多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM)是临床上最为常见的一种高度恶性颅内肿瘤,总体预后很差,在正常标准治疗的情况下,病人的中位生存期仅14个月。随着科学技术的不断发展和医疗水平的进步,对于GBM的诊断和治疗都取得了显著进展,但是患者的预后情况并没有得到明显的改善。因此,对于胶质瘤发病机制的研究显得尤为重要,其中寻找与胶质瘤发病相关的基因突变并明确其作用机理对于更好的理解疾病发生的分子机制和确立新型的诊断和治疗的靶点有着重要的意义。髓细胞白血病-1(Myeloid leukemia cells-1, Mcl-1)蛋白是Bcl-2抗凋亡蛋白家族的成员,其参与了细胞周期、细胞凋亡和细胞分化过程的调控。目前的研究结果显示Mcl-1在细胞中过量表达能够导致恶性肿瘤的发生,抑制Mcl-1蛋白的表达水平,则能起到促进肿瘤细胞的凋亡的作用,同时能够增加其对化学治疗和放射治疗的敏感性。Mcl-1抗凋亡的可能机制是其与促凋亡蛋白结合后可抑制其促凋亡的作用。Mcl-1发生突变后可能对Mcl-1的代谢及相关信号传导通路产生一定的影响,从而增强其抗凋亡的作用,可能是胶质瘤发生的一个潜在机制。本研究筛选了文献报道中20个与恶性肿瘤发生、发展密切相关的基因,包括Mcl-1, Bcl-2, EGFR, KRAS, FGR, ASAP3, BTG1, TP53, PAX5, BRAF, ZMYM3, ARF, Bcl-6, VEGF, HER2, β-Catenin, c-myc, Rb, SORCS1, E2F作为候选基因。通过Sanger直接测序法在20名胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织中检测了这些基因的突变情况。在其中4个候选基因中我们筛选到5个体细胞非同义编码突变,其中的两个突变位于髓细胞白血病-1基因(Mcl-1)的PEST区域(c.447A>G,p.D155G和c.521T>C,p.L174S)。我们进一步检测了另外43例胶质瘤患者的Mcl-1基因序列,在相邻位置又发生了一个新的基因突变位点(c.446G>C,p.D155H)。同时我们在肿瘤样本和瘤旁脑组织样本中分别在mRNA水平和蛋白水平检测了Mcl-1的表达情况。在进一步的功能实验中发现体细胞的突变能够干扰Mcl-1的降解。相对于过表达野生型Mcl-1的细胞,转染突变基因的胶质瘤细胞生长较快,抗凋亡能力增强,细胞侵袭迁移能力明显变强。在裸鼠实验中发现携带突变型Mcl-1.基因的肿瘤细胞体内生长速度明显高于携带野生型Mcl-1基因的肿瘤细胞。在本文的研究中,我们第一次鉴定了GBM中包括Mcl-1在内的6处突变基因位点,同时发现位于Mcl-1基因PEST区域的3个位点(D155G、L174S、 D155H)的突变能够通过降低细胞内Mcl-1蛋白的降解速度,增加细胞中Mcl-1蛋白聚集的浓度,从而达到抑制细胞凋亡、增强肿瘤细胞增殖及侵袭能力的作用。我们的研究为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的潜在的治疗靶点,为更深入的探寻临床治疗的新方案提供了理论基础和实践的可能性。第一部分 多形性胶质母细胞瘤中髓细胞白血病-1基因突变的鉴定目的： (1)比较胶质母细胞瘤病人肿瘤组织中20个肿瘤相关基因突变情况的差异,初步筛选出胶质母细胞瘤相关的突变基因。 (2)初步探讨基因突变对相关蛋白在转录、翻译水平表达量的影响。方法： (1)应用Sanger直接测序的方法检测20例人胶质母细胞瘤肿瘤组织中20个肿瘤相关基因,确定GBM相关基因突变的位置及类型。(2)扩大样本量,对另外43例GBM样本针对目标基因进一步行Sanger测序验证。(3)应用免疫组化方法检测肿瘤组织中和相应瘤旁脑组织中Mcl-1蛋白定位及表达情况。(4)通过Western Blot方法检测肿瘤组织中和相应瘤旁组织中Mcl-1的蛋白表达量。(5)通过qPCR技术检测肿瘤组织中和相应瘤旁脑组织中Mcl-1 mRNA表达的差异。结果：(1)在20例GBM样本中,我们鉴定出5个体细胞非同义编码突变,它们分布在4各候选基因,其中的两个突变为位于髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)的PEST区域中的D155G和L174S。 (2)在另外43例GBM样本中,除了上述2个Mcl-1基因突变位点外,我们又发现了另一个附近区域的突变位点D155H。三个突变位点均位于Mcl-1基因的PEST区域中。(2)免疫组化和Western Blot结果显示,肿瘤组织中Mcl-1蛋白主要定位于肿瘤细胞胞质内,其在肿瘤组织中的表达量明显高于瘤旁组织。(4)qRT-PCR实验结果显示GBM肿瘤组织中的Mcl-1转录水平的表达高于瘤旁组织。结论：(1)胶质母细胞瘤中存在多个体细胞突变位点,其中3个基因突变位点(D155G、L174S和D155H)位于Mcl-1蛋白N端的PEST区域。(2)与瘤旁脑组织相比,肿瘤组织无论在mRNA水平还是蛋白水平,Mcl-1的表达量均明显升高,Mcl-1基因突变可能与GBM的发生、发展有一定的关系。第二部分Mcl-1基因突变对胶质母细胞瘤增殖、凋亡、迁移的影响及可能的机制目的：(1)研究Mcl-1基因突变对胶质母细胞瘤增殖、凋亡能力的影响；(2)研究Mcl-1基因突变对胶质母细胞瘤迁移能力的影响； (3)研究Mc1-1基因突变对胶质母细胞瘤细胞内信号传导通路的影响；(4)研究Mcl-1基因突变对Mcl-1蛋白的半衰期的影响；(5)研究Mcl-1基因突变对U251细胞体内成瘤能力的影响；方法：(1)构建pcDNA4-Mcl-1转染质粒,通过QuickChange Site-directed Mutagenesis试剂盒,诱导Mcl-1基因特定位点发生定向突变,得到Mcl-1widetype、Mcl-1-D155G、Mcl-1-D155H、Mcl-1-L174S四种不同亚克隆。瞬时转染U251细胞,得到四种亚克隆转染的肿瘤细胞。qPCR和Western blot方法鉴定转染后Mcl-1 mRNA和蛋白质表达量的变化。(2)MTT法检测Mcl-1 widetype、 Mcl-1-D155G、Mcl-1-D155H、Mcl-1-L174S四种U251细胞增殖能力的差异；(3)流式细胞术检测野生型和突变型Mcl-1蛋白对细胞凋亡的影响。(4)Transwell小室实验检测野生型和突变型Mcl-1蛋白对肿瘤细胞迁移能力的影响。(5)Western blot方法检测转染后细胞内Akt和p-Akt蛋白表达量的差异,分析Mcl-1突变对细胞内Akt信号传导通路的影响；(6)35S甲硫氨酸脉冲追踪标记的方法检测野生型和突变型Mcl-1蛋白半衰期的差异。 (7)裸鼠成瘤实验观察野生型和突变型Mcl-1蛋白对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。结果：(1)在蛋白水平和mRNA水平均证明了U251细胞转染成功；(2)突变型细胞Mcl-1-D155G、Mcl-1-D155H、Mcl-1-L174S增殖能力较野生型细胞Mcl-1 widetype明显增强；(3)、Mcl-1-D155G、Mcl-1-D155H、Mcl-1-L174S细胞抗凋亡能力明显高于Mcl-1 widetype细胞；(4) Mcl-1-D155G、Mcl-1-D155H、 Mcl-1-L174S细胞侵袭能力较Mcl-1 widetype细胞增强；(5)野生型和突变型细胞中Akt和p-Akt蛋白表达量未见明显差异；(6)通过脉冲追踪标记的方法发现相比野生型细胞,Mcl-1-D155G、Mcl-1-D155H、Mcl-1-L174S突变细胞内Mcl-1蛋白的半衰期明显延长,约为Mcl-1 widetype细胞的2倍；(7)突变型细胞在裸鼠体内成瘤良好,肿瘤重量及体积明显大于野生型细胞。结论：(1)Mcl-1基因突变促进胶质母细胞瘤增殖、迁移能力,抑制肿瘤细胞凋亡。(2)Mcl-1基因突变可能通过减缓Mcl-1蛋白降解,延长Mcl-1蛋白半衰期,导致Mcl-1蛋白在细胞中聚集；(3)Mcl-1突变并未明显影响Akt信号通路活性。