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植物个体的生长发育要经历营养生长(vegetative growth)向生殖生长(reproductive growth)的转换,而这种转换的过程和时间往往与作物产品器官的产量和质量高度相关。近年来有关植物遗传学的研究结果表明,miR156通过SPL家族的基因调控植物营养生长的时相转换(phase transition),miR319a通过TCP家族基因调控叶的大小、形状和卷曲。植物形态的转换和时相转换是两个不同的发育程序,具有不同的基因调控机制,但是彼此又相互关联,共同决定植物生长发育的进程。这种情况表明,miR156和miR319a指导的基因沉默途径之间有交互作用。了解这种交互作用的机制和形态学基础对于人们深入了解植物生长发育的遗传机制,在遗传上改良作物的农艺性状有重要指导意义。 植物营养生长时期(vegetative stage)可以分为幼年态(juvenile phase)和成年态(adult phase)两个时相。幼年期、成年期时相和生殖生长时期(reproductivestage)的叶在大小、形状、卷曲和夹角等形态特征上明显不同。为了澄清植物形态特征与时相转换或时期转换之间的相互关系,我们首先考察了miR319a及其靶基因TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF4(TCP4)在突变和过表达情况下对拟南芥营养生长时期和生长发育时相转换的影响。在过表达miR319a和TCP基因沉默的jaw-D突变体中,与野生型相比,进入成年期的叶数不变,但是完成幼年期所需的日数增加,叶起始速率降低,生殖生长时期显著延迟;幼年期的日数略微增加,成年期显著延长,生殖生长的时期大幅度延长。这说明,TCP基因沉默不改变营养生长时相的转换,但是显著延迟了营养生长向生殖生长的时期转换,延长了生殖生长的时期。与此相对应,jaw-D突变体中miR156的积累量未显著增加,但是SPL3、SPL4和SPL5基因显著下调,SPL9、SPL10和SPL15基因无明显下调。在过表达TCP4的转基因系p35S:TCP4中,营养生长的时相转换无显著变化,但生殖生长时期显著提前,成年期和生殖生长时期显著缩短。与此同时,p35S: TCP4中SPL3、SPL4和SPL5基因明显上调,但miR156的积累量未显著降低。为了考察植物体内TCP4蛋白是否结合SPL3/4/5的启动子,我们利用TCP4-YFP转基因植株,通过染色质免疫共沉淀(ChIP)分析的手段,在SPL3/4/5基因启动子上的TCP4结合位点区附近分别设计了引物进行扩增。结果发现,TCP4能有效地结合在SPL3/4/5基因的启动子上,表明SPL3/4/5表达直接受到TCP4的转录调控。EMSA实验也验证了这个结果。因此,我们认为,miR319a通过TCP4基因负向调控SPL3、SPL4和SPL5基因,从而调控营养生长向生殖生长的时期转换。 然后,我们考察了miR156及其靶基因SPL(SQUAMOSA PROMOTERBINDING PROTEIN-LIKE)基因在突变和过表达情况下对叶大小、形状、卷曲和夹角等形态特征的影响。在过表达miR156和SPL基因沉默的eMIR156a转基因系中,与野生型相比,莲座期叶的叶长/叶宽比值降低,叶形由圆形转化为卵圆形。与此同时,TCP4基因的积累量没有显著变化。在过表达SPL3、SPL4和SPL5的转基因系中,与野生型相比,莲座期叶片明显减小;TCP4基因积累量也没有显著变化。结果表明,miR156及其靶基因SPL3、SPL4和SPL5基因对TCP4基因调控不明显。 为了探讨miR156和miR319a调控途径之间的遗传关系,我们通过miR156和miR319a及其靶基因突变体或转基因进行杂交获得了一批双突变株系。在植株的时相转换上,p35S:rSPL3/4/5株系回复jaw-D生殖生长延迟的表型,eMIR156a株系减弱jaw-D突变体生殖生长延迟的表型。TCP基因沉默的jaw-D突变体不改变过表达miR156的eMIR156a转基因株系成年期延迟的表型,也不改变过表达SPL3/4/5的株系成年期提前的表型。在叶形态上,过表达eMIR156a转基因株系不加重jaw-D突变体叶面积增大、叶皱缩和叶缘波浪状的突变表型,也不改变p35S:TCP4株系叶面积减小和叶上卷的表型;过表达SPL3/4/5的株系不改变jaw-D突变体的表型,也不改变p35S:TCP4株系的表型。结果表明,TCP4在调控营养生长向生殖生长的时期转换方面是SSPL3/4/5的上游基因。 此外,TCP4还通过FT基因正反馈调控SPL3/4/5的表达,年龄和光周期信号调控SPL3/4/5依赖于TCP4,而TCP4表达也受年龄和光周期信号的调控。TCP4和SPL3/4/5的表达都存在昼夜节律,且都在白天结束的时候达到表达水平的峰值,说明TCP4可能介导光周期对SPL3/4/5的表达调控作用。 本项研究揭示了植物营养生长向生殖生长时期转换的基因调控机制,发展了植物生长发育的理论,为遗传和生理上调控作物生殖生长的时期,改良作物的产量和品质提供了科学依据。