【摘 要】
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普瑞巴林(Pregabalin,PGB),化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸(S-3-aminomethyl-5-methylhexanoic acid)是治疗癫痫、神经病理性疼痛及抗焦虑的一线药物。Pfizer公司成功开发
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普瑞巴林(Pregabalin,PGB),化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸(S-3-aminomethyl-5-methylhexanoic acid)是治疗癫痫、神经病理性疼痛及抗焦虑的一线药物。Pfizer公司成功开发了第二代普瑞巴林合成工艺,该工艺引入Novozymes公司开发的来源于嗜热丝孢菌脂肪酶TLL(Thermomyces lanuginosus lipase)的商品化酶Lipolase~?选择性拆分外消旋体2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)合成普瑞巴林中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。本研究旨在进一步挖掘新型、具有自主知识产权的脂肪酶,为化学-酶法合成普瑞巴林提供高效生物催化剂。本论文以手性生物合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸为目标,通过基因挖掘获得嗜热踝节菌脂肪酶(Talaromyces thermophilus lipase,TTL)。构建了重组表达TTL工程菌Escherichia coli BL21/pET28b-TTL,其在16℃诱导表达时目的蛋白可溶性显著提高,其水解CNDE的活力为1.6 U/g,是28℃诱导表达时的3倍。同时,TTL基因成功在毕赤酵母中表达。为了提高TTL对CNDE的水解活力,开展了对TTL同源建模及分子改造研究。以“盖子”为打开状态的TTL模型1DTE为模板,使用Modeller构建TTL的3D模型并利用分子对接选取突变位点。通过定点饱和突变、pH指示剂高通量筛选和气相色谱复筛,经分离纯化后,获得单突变体L147R和G91V,其活力分别是野生型TTL的1.51倍和2.15倍,在G91V基础上筛选到双突变体G91V/S58M和G91V/S83T,比活力分别是TTL的2.29倍及3.62倍。突变体G91V/S83T催化CNDE水解的最适温度为50℃,在40℃、50℃、60℃的半衰期分别是21.2 d、14.5 d、8.0 d,具有较好的温度稳定性。最适pH为8.0,在pH 7.0-8.5的条件下稳定性好。对突变体活力提高的机理进行分析:当147位点由Leu突变为Arg后,与116位Ser的-OH形成氢键相互作用力,稳定催化过程中形成的酶-底物过渡态。91位点位于脂肪酶的“盖子”结构上,将其由Gly突变为Val后,“盖子”结构的疏水性增大后,在催化反应过程中更易于打开,从而提高了酶的催化速率。83位点的Ser突变为Thr后,其β-OH与配体S-CNDE的氢键长度由3.2?,缩短为2.6?,键长缩短可能对氧负离子洞稳定底物过渡态起到作用。58位点Ser突变为Met后,增加了氢键网络导致活性口袋极性降低。突变体G91V/S83T在50℃,pH 8.0条件下催化100 mM外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解,8 h后,转化率达42%以上,且产物ee值>94%,表明该突变体在化学-酶法合成普瑞巴林中具有较大潜力。
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