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本论文完成两株链霉菌jys28和ATCC53615次生代谢产物的分离与鉴定。通过对ATCC53615菌株进行基因组测序、构建基因组文库、基因敲除、基因回补、中间代谢产物的分离鉴定,部分阐明了fervenulin在ATCC53615菌株中的生物合成。首先,从本实验室菌种库中通过小量发酵-HPLC分析和抑菌活性筛选,挑选出两株链霉菌jys28和ATCC53615。经过大量发酵、萃取、分离、鉴定,从jys28获得8个化合物,其中6个为新化合物(包括2个咔唑结构的化合物、1个玉红霉素类化合物和3个肽类化合物)。从ATCC53615分离鉴定了4个已知化合物,包括毒黄素(toxoflavin)的类似物fervenulin。Fervenulin、toxoflavin和reumycin是水稻黄枯萎病的致病因子,它们有相同的母核。关于toxoflavin的生物合成在伯克氏菌BurkholderiaglumaeBGR1中已有报道,但是在链霉菌中的生物合成并未有报道,它的N-N键是如何形成还是不清楚,并且关于fervenulin的生物合成相关的甲基转移酶还未有报道。随后,以ATCC53615为原始菌株,对fervenulin在链霉菌中的生物合成展开研究。因为原始菌株ATCC53615基因敲除比较困难,所以选择异源表达的方法对fervenulin进行研究。经过基因组测序和同源比对,在ATCC53615基因组中找到了fervenulin的生物合成疑似基因簇。经过基因组文库的构建和筛选,找到包含基因簇的质粒,以StreptomiyceslvidansM1152为宿主菌进行异源表达。从异源表达菌株S.lividansM1152/p5F11中分离得到化合物toxoflavin。以p5Fl1为基础质粒进行基因敲除,当基因Shi4237敲除后,异源表达突变菌株的发酵液中可以检测到fervenulin,因此确认了p5F11含有fervenulin和toxoflavin生物合成的基因簇。其次,通过对异源表达菌株和基因突变菌株进行了发酵、提取和代谢产物的分离鉴定,从异源表达菌株S.lividsanMl152/p5Fl1分离得到D-Ribitol,l-deoxy-l-[1,3,4,7-tetrahydro-6-(1H-indol-3-yl)-2,4,7-trioxo-8(2H)-pteridinyl](化合物22);从RibD的同功酶Shi4234的基因敲除菌株S.lividansM1152/p5F11Δ4234中分离得到化合物23和24,其中化合物23是化合物22氨基未被氧化为羰基的形式,化合物24是化合物22氨基未被氧化成羰基和呋喃核糖未被开环的形式。RibD是核黄素(riboflavin)生物合成途径中负责脱氨和还原的双功能酶,化合物23和24的分离首次从代谢产物方面验证了Shi4234的功能。最后,通过对基因簇及上下游分析,寻找到4个甲基转移酶基因Shi4222、Shi4227、Shi4232和Shi4237。通过体外酶促反应,证实了4个甲基转移酶的功能,Shi4232和Shi4237分别催化Pyrimido[5,4-e]-as-Triazine-5,7(6H,8H)-dione(化合物15)的N6和N1甲基化生成toxoflavin,且两个甲基生成没有顺序选择性,Shi4222或Shi4227可催化化合物15分别生成8-methylpyrimido[5,4-e]-as-Triazine-5,7(6H,8H)-dione(化合物20)和fervenulin,Shi4232催化化合物15生成reumycin,也可以催化化合物20生成fervenulin。这是首次报道fervenulin生物合成的相关甲基转移酶的甲基化网络。综上所述,本论文完成了链霉菌jys28和ATCC53615次生代谢产物的分离与鉴定。以链霉菌ATCC53615为原始菌株,应用异源表达的方法部分阐明了fervenulin在链霉菌ATCC53615菌株中的生物合成研究。通过基因敲除证实,fervenulin及其类似物的生物合成在伯克氏菌B.glumaeBGR1和链霉菌ATCC53615中基本一致。通过对异源表达突变菌株中间代谢产物的分离与鉴定,从代谢产物方面首次验证了Shi4234基因的功能。通过蛋白表达、体外酶促实验,结合基因敲除实验,首次报道fervenulin生物合成的相关甲基转移酶的甲基化网络。同时本研究结果也表明,在链霉菌ATCC53615和伯克氏菌B.glumaeBGR1中,toxoflavin生物合成途径中的甲基化过程是不相同的,从侧面为天然产物生物合成过程中相同的化合物可由不同的途径合成提供了一个研究实例。