谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)分枝硫醇氧还蛋白Mrx1的生理功能及其机制研究

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高G+C%含量的革兰氏阳性谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)不仅是系统生物学研究中多种病原菌的典型模式生物,而且可作为生物基细胞工厂,被广泛用于氨基酸、核苷酸、有机酸、乙醇、二胺、多聚物、高价值蛋白等人类所需食品、化学品、材料和燃料的工业发酵生产。然而,在生物基产品发酵过程中,不可避免会受到产生胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的各种环境胁迫,从而影响到细菌的生理状况、性质及发酵终端产品的优劣,甚至影响到菌株存活。工业微生物稳定的鲁棒性表现在良好的抗氧化能力。为了对抗氧化压力和在极端环境下存活,微生物应用各种抗氧酶随时感知和监测细胞内氧化还原状态的变化,包括直接清除ROS的末端过氧化物酶、二硫氧化还原酶(硫氧还原蛋白Trx和谷氧还原蛋白Grx)、调控蛋白等。其中,Grx作为一种依赖谷胱甘肽(GSH)的二硫氧化还原酶,在催化各种硫醇-二硫键交换反应、维持细胞的氧化还原平衡和抗氧酶活性方面扮演重要角色。虽然C.glutamicum中与Grx同源的分枝硫醇氧化还原酶(mycoredoxin-1 Mrx1)已被证明具有脱分枝硫醇活性,但目前关于Mrx1的生理表型、生化特性及调控机制研究甚少。因而,在本研究中,我们以C.glutamicum中的Mrx1为研究对象,揭示Mrx1内在生理表型及其发挥这些功能的生化特性,主要结果如下:1.我们采用野生菌(WT)、Mrx1缺失突变体(Δmrx1)及其互补菌(Δmrx1+),检测Mrx1在C.glutamicum中对氧化剂、烷化剂、重金属和抗生素的抗环境胁迫作用。结果表明,C.glutamicum中mrx1基因缺失突变体对氧化剂(过氧化氢、异丙苯过氧化氢、甲萘醌、联氨)、烷化剂(碘乙酰胺和1-氯2,4-二硝基苯)、重金属(氯化镉)等环境胁迫因素高度敏感,对抗生素(新霉素、庆大霉素、万古霉素和阿奇霉素)具有中等敏感性。这些结果表明Mrx1介导了C.glutamicum对上述胁迫的抗性过程,揭示了Mrx1在维持C.glutamicum抗氧化应激方面发挥重要作用。2.Mrx1是依赖MSH/Mtr/NADPH还原系统进行自身还原性循环再生的。3.与Grx功能相似,Mrx1协同MSH/Mtr/NADPH电子系统不仅能还原核糖核苷酸还原酶(RNR)、牛胰岛素(insulin)和5,5’-二硫基-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等二硫化物,而且能还原HED-SSM和Prx-SSM分枝硫醇化混合二硫化物。但是Mrx1还原HED-SSM和Prx-SSM时仅涉及CXXC N端活性位点半胱氨酸,而还原二硫化物时必须在其活性位点CXXC的N端和C端半胱氨酸都存在时才能发挥作用。这些结果说明Mrx1采用二硫机制还原分子内或分子间二硫键,而采用单硫机制还原分枝硫醇化混合二硫键。4.SigH涉及响应C.glutamicum中氧化应激反应,正调节硫氧还原蛋白系统(trx B和trx C)和分枝硫醇系统内至少一个相关基因(mtr)。各种胁迫因子(Vancomycin、Cd Cl2、MEN和H2O2)均会诱导C.glutamicum中mrx1基因的表达,并且通过凝胶阻滞实验(EMSA)发现Sig H对Pmrx1基因有直接正调控作用。综上所述,本研究发现C.glutamicum中Mrx1具有抗环境胁迫的生理功能,而发挥其生理功能的内在机制主要是通过二硫和单硫机制修复各种抗性酶中的二硫键和分枝硫醇化混合二硫键、维持胞内抗性蛋白的活性以及维持胞内还原态等方式实现的,这对于增强复杂发酵环境中C.glutamicum的鲁棒性具有重要意义。
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