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本论文就猪血为原料同时提取血红素、超氧化物歧化酶、凝血酶并回收珠蛋白的工艺进行了较为深入的研究,结果如下:
1.确立了超声破碎溶血的方法及最佳条件为:功率400W,10min,红细胞破碎率达100%;
2.采用浓盐酸与丙酮的体积比为1:100的酸化丙酮提取血红素,在同时提取血红素、超氧化物歧化酶的条件下,1L全血能得到纯度高达99.9%的血红素6.0g。
3.采用热变性法纯化SOD,并确立最佳变性温度为60℃。确定了50%饱和度硫酸铵盐析去除杂蛋白,90%饱和度硫酸铵盐析得到SOD粗酶样品的方法,并通过中空纤维膜超滤浓缩5倍得到SOD纯品。该工艺条件下,1L全血可提取SOD50.1mg,比活达6523U·mg-1,活力回收达71%,纯化倍数108.3。经SDS-PAGE电泳验证为单一的谱带,其分子量为32KDa。
4.以生理盐水配制的凝血酶原溶液,以CaCl2溶液为激活剂时,其最适激活条件为:溶液中Ca2-浓度为0.1mol·L-1、室温下激活时间1.5h。
5.采用DEAE-Sephrose阴离子交换柱层析纯化凝血酶,最终1L血能得到凝血酶2.05mg比活达到1810.2U·mg-1。,活力回收达49.7%,纯化倍数31.5。所得凝血酶经SDS-PAGE电泳验证为电泳纯,其分子量为33,580Da,等电聚焦电泳测定其等电点为5.5左右。且血浆经-20℃冷冻处理其分离效果明显优于末处理血浆。
6.回收了血红蛋白中的珠蛋白,粗蛋白含量达92.72%,并通过单因素和正交实验确定了Protamex复合蛋白酶酶解珠蛋白的最适条件为:珠蛋白浓度3%,pH6.5,Protamex复合蛋白酶添加量为0.1281Au/g底物,水解温度45℃,水解6 h,水解度达0.5269。