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我国是日本血吸虫病的主要流行区,至2016年底,我国仍有54454例血吸虫病病例报告。血吸虫病属于慢性感染性免疫疾病。其可溶性成虫抗原（soluble worm antigen,SWA）和可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）均可引起宿主免疫应答。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）是肝脏的非实质细胞,也是介导肝纤维化的主要效应细胞。目前对于血吸虫感染过程中HSCs持续活化的诱导因子和信号通路等尚未十分了解,在临床上现也没有有效的靶点和方法来治疗血吸虫病肝纤维化。炎性小体作为先天性免疫系统组分之一的多蛋白寡聚物,通过加工Caspase-1和IL-1β参与肝脏炎症过程。NLRP3小体是近年来研究最广泛、特征最明显的炎症小体。研究表明,NLRP3炎症小体及其下游效应因子在肝脏炎症和肝纤维化发展中发挥着中心作用。我们之前的研究也表明,在血吸虫感染早期HSCs就存在NLRP3炎症小体的激活和α-SMA的表达,并在急性期和慢性期呈持续高表达NLRP3炎症小体。因此我们推测,SWA和SEA可能在诱导HSCs内NLRP3炎症小体活化及HSCs的持续活化、介导胶原合成中发挥重要作用。除了虫源性因素,活性氧（ROS）也是重要的炎症和纤维化诱导因素,是机体遭受各种有害刺激时发生氧化应激反应的产物。ROS可以通过细胞内信号传导来刺激HSCs活化、增殖和胶原合成。现在认为NLRP3炎症小体的激活需要ROS的参与。因此我们推测,ROS在介导HSCs NLRP3炎症小体激活和α-SMA、ColI表达中有重要的作用。我们之前的实验发现,在血吸虫感染小鼠肝脏内ROS主要来源于巨噬细胞和HSCs。因此我们着眼于HSCs自身的ROS和巨噬细胞的ROS,观察它们各自对HSCs NLRP3炎症小体形成活化,以及α-SMA、ColI表达的作用。本课题主要研究SWA和SEA对LX-2细胞内炎症小体激活,α-SMA和ColI表达的影响,并观察了 SWA对LX-2细胞焦亡的影响。接着我们探讨了 SWA和SEA诱导的LX-2细胞和巨噬细胞的ROS在LX-2细胞NLRP3炎症小体持续激活,α-SMA和ColI表达的作用,以期进一步阐明血吸虫病肝纤维化的致病机制。本文进行了以下几个方面的研究:1.日本血吸虫虫源性因素SWA和SEA诱导LX-2细胞NLRP3炎症小体活化和胶原表达使用不同浓度的SWA和SEA（25,50,100μg/ml）刺激LX-2细胞。采用RT-qPCR 和 Western blotting 检测了 NLRP3 炎症小体活化相关（NLRP3,IL-1[3和Caspase-1）,肝星状细胞活化标记（α-SMA）与纤维化相关（ColI）的基因和蛋白表达,同时使用ELISA检测IL-1β的分泌情况。结果显示SEA和SWA浓度达到100μg/ml时,可诱导LX-2细胞NLRP3炎症小体形成和活化,同时,α-SMA和ColI的表达也开始升高。此外,我们用SEA和SWA联合刺激模拟体内虫卵和虫体同时存在的情况,并与单独刺激进行比较,发现使用50μg/ml SEA和50μg/ml SWA联合刺激,没有引起NLRP3、Caspase-1、α-SMA和ColI的表达,但是IL-1β的表达却显著升高。使用100μg/ml SEA和100μg/ml SWA联合刺激时,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、α-SMA和ColI的基因表达和IL-1β的分泌水平均显著上升。这提示我们在血吸虫感染致肝脏疾病中,SWA和SEA均可以引起HSCs中NLRP3炎症小体形成和活化,且与HSCs活化和胶原表达密切相关。SWA和SEA对HSCs NLRP3炎症小体活化的影响并不是简单的叠加作用,并且可能存在其他途径诱导了 IL-1β的表达,这需要进一步探讨。2.SWA引起LX-2细胞发生细胞焦亡实验室前期已经发现SEA可以促发LX-2细胞内由NLRP3炎症小体活化而引起的细胞焦亡。在本实验中我们进一步观察了 SWA致LX-2细胞细胞焦亡的作用。在SWA刺激LX-2细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力,使用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测细胞LDH的释放,及Western blotting检测活化Caspase-1酶的表达。结果显示,随着SWA浓度的上升,细胞活力下降,LDH释放增加,活化的Caspase-1表达增多。以上结果显示,在SWA的作用下,LX-2细胞活力下降并有剂量依赖性,并且SWA可以诱发细胞焦亡。3.抑制ROS降低了 SWA和SEA诱导的LX-2细胞NLRP3炎症小体活化和胶原表达为了进一步评价ROS在血吸虫感染致HSCs NLRP3炎症小体活化和胶原表达中的作用,我们首先采用流式细胞仪分析了 SWA和SEA对LX-2细胞ROS的影响。结果显示,SWA和SEA均可引起LX-2细胞的氧化应激产生ROS。之后,使用NAC清除细胞内的ROS,再检测相关基因和蛋白表达。结果显示,细胞内NLRP3炎症小体形成和活化减少,α-SMA和ColI的表达也被抑制。这提示我们,LX-2细胞内ROS的增多是SWA和SEA诱导NLRP3炎症小体激活和胶原表达的重要因素。4.SWA和SEA诱导巨噬细胞产生的ROS对LX-2细胞NLRP3炎症小体的活化巨噬细胞也是血吸虫感染过程中ROS的重要来源。为了进一步确认虫源性因素诱导巨噬细胞ROS的作用,我们采用流式细胞仪分析了 SWA和SEA对THP-1巨噬细胞ROS的影响。结果显示,SWA和SEA均可以诱导THP-1巨噬细胞产生ROS。之后,采用Transwell共培养虫源性因素孵育的巨噬细胞和正常的LX-2细胞,观察到处理后的巨噬细胞可以诱导LX-2细胞NLRP3炎症小体形成和活化。为了评价巨噬细胞产生的ROS在此过程中的作用,我们使用NAC抑制了 THP-1巨噬细胞内的ROS,发现LX-2细胞内NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达均被抑制。结果提示,虫源性因素不仅可以直接作用于HSCs,同时也可以通过诱导巨噬细胞ROS间接作用于HSCs细胞诱导其NLRP3炎症小体的形成和活化。综上所述,本研究发现血吸虫虫源性因素SWA和SEA是引起LX-2细胞内NLRP3炎症小体形成、细胞持续活化和胶原合成的重要因素;并且,在SWA和SEA作用下引起的HSCs和巨噬细胞内ROS的释放可能是导致上述变化的重要机制之一。本研究进一步丰富了血吸虫感染相关的虫源性因素和内源性因素与HSCs NLRP3炎症小体活化和胶原合成关系的认识。