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肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路。与肾功能恶化密切相关，是进展性肾病的主要病理特征。研究表明，多种细胞因子参与调节TIF，其中转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β起到中枢作用。但TGF-β生物学效应复杂，完全阻断其表达并不现实。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是TGF-β介导的肾间质纤维化的重要下游效应因子，成为抗纤维化治疗新的靶点。
19-29核苷酸的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)应用于哺乳动物细胞能特异性的降解靶mRNA，导致基因沉默。病毒或逆转录病毒载体是目前介导DNA或RNA片段转移最有效的方法。因此使用逆转录病毒载体介导siRNA阻断CTGF表达或抑制其活性，可能是一种更特异、更有效地防治肾纤维化的手段。
本研究在体外观察高糖对人近曲小管上皮细胞(HKC)表达CTGF，Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ，col Ⅰ)，纤维粘连蛋(fibronectin，FN)等的影响，以及构建的逆转录病毒载体PRS介导的结缔组织生长因子siRNA(命名为PRS-CTGF-siRA高糖诱导效应的抑制作用。
方法:(1)构建表达人CTGF siRNA的PRS-CTGF-siRNA逆转录病毒载体；(2)体外培养HKC，用不同浓度D-葡萄糖(5.5，30，60mM)刺激细胞48h；选取30mM D-葡萄糖作用于细胞不同的时间点(0，12，24，48，72h)，用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及Western blot方法检测HKC中CTGFmRNA和蛋白表达水平的时间和浓度效应；(3)选取高糖(30mM，48h)刺激HKC，观察逆转录病毒载体PRS介导的结缔组织生长因子siRNA对HKC的影响。实验分组如下：①对照组(含5.5mM D-葡萄糖的无血清DMEM培养)；②高糖组(用含30mM D-葡萄糖的无血清DMEM培养)；③高糖+siRNA组(用含30mM D-葡萄糖的无血清DMEM对PRS-CTGF-siRNA逆转录病毒液感染后的稳定细胞培养)；④高糖+PRS组(用含30mM D-葡萄糖的无血清DMEM对空载体PRS逆转录病毒液感染后的稳定细胞培养)；⑤代谢渗透压对照组(含24.5mM甘露醇无血清DMEM培养)。用RT-PCR测定CTGF,colI，FN mRNA的表达效应，western blot方法测定colI,CTGF蛋白水平的影响。每组重复实验5次，取3次结果计算，以平均值士标准差表示。
结果：经酶切与测序证实PRS-CTGF-siRNA构建成功；高糖以剂量依赖和时间依赖方式上调HKC中CTGFmRNA表达；在高糖(30mM，48h)刺激下，colI，FN mRNA表达量亦显著增加(P<0.01)，PRS-CTGF-siRNA能可显著抑制HKC CTGF,FN和colI mRNA表达的增加(p<0.01)，亦可明显抑制胞内CTGF,colI蛋白合成(p<0.01)。
结论：(1)高糖以浓度一时间依赖的方式引起HKC分泌CTGF异常增加,可上调colI、FN的表达，促进肾纤维化的发生；(2)PRS-CTGF-siRNA可显著抑制高糖对HKC的诱导效应，下调CTGF表达，减少colI、FN生成，提示阻断CTGF的表达能抑制ECM合成，从而可能抑制肾脏纤维化。