角膜移植术后免疫排斥反应是由多种免疫细胞和免疫分子共同参与的复杂的免疫反应过程。虽然角膜自身具有前房相关性免疫偏离与免疫赦免的特点,但移植术后的排斥反应仍是造成角膜移植失败的主要原因。长期以来,防治免疫排斥反应成为研究角膜移植的重要方向。目前临床上普遍采用的非特异性免疫抑制疗法,只是“治标”的方法,疗效有限且毒副作用大。近年来,应用某些药物可以更有效抑制角膜移植排斥反应的发生,从而延长角膜植片的存活时间,成为研究角膜移植术后排斥反应的方向之一。研究背景熊果酸,又名乌索酸、乌苏酸、α-香树脂醇,是一种弱酸性五环三萜类化合物,能够从多种天然植物提取的功能成分。纯品一般为白色针状结晶(乙醇中结晶),味略微苦,基本骨架是由多氧蒎的五环母核所构成的。化学名3-Hydroxy-12-ursen-28-oic acid,分子式C30H11803,相对分子质量456.68,熔点285-291℃,可溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮,略溶于丙酮,微溶于苯、氯仿、乙醚,易溶于二氧六环、吡啶,不溶于水和石油醚。熊果酸不仅仅对多种恶性肿瘤的增殖具有明显的细胞毒作用,而且能够诱导细胞分化及抑制新生血管的形成,还对多种致癌促癌物质造成的细胞癌变具有抵抗作用。另一方面,能够抑制肿瘤细胞增殖和血管内皮细胞形成,有抗菌、抗糖尿病、抗新生血管、抗溃疡、降低血脂、抗组织氧化及增强机体免疫功能等多种生物学作用和药理活性。在角膜移植术后的免疫排斥反应过程中,主要是由CD4Th1细胞起作用的。核因子NF-κB是一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子KB序列特异结合的蛋白因子,是在B细胞核提取物中发现的。研究发现,不仅能够大量存在于真核细胞内,而且能够与多种细胞基因的启动子序列或增强子序列的特定位点发生特异性结合,从而促进其转录和表达。另外,NF-κB在炎症、肿瘤、过敏反应等疾病的发生、发展过程中具有重要的作用,能够与细胞的增生、转化和凋亡,以及炎症、免疫应答反应等重要的病理生理过程紧密联系。NF-κB可上调T细胞表面B7共刺激分子与MHC-Ⅱ勺表达,刺激Thl细胞因子IL-2与IFN-γ的产生。熊果酸抑制NF-κB的活性,从而下调IL-2、IFN-γ分子的表达情况,延长移植物存活时间。熊果酸是通过PKC-lκ-Bα-NF-κB信号通路介导免疫抑制的,抑制IK-Ba磷酸化和核因子NF-KBp65核转录,导致由PKC磷酸化的NF-κB活化抑制。NF-κB是炎症和免疫反应过程中重要的调节因子,能够调节T细胞活化、增殖与基因转录。由p50、p65两个异质二聚体构成,与抑制亚基单位Iκ-Bα结合,存在于未活化状态的胞液中。通过Iκ-B激酶,使抑制亚基单位κ-Bα的丝氨酸32、36部位磷酸化,磷酸化的作用在于泛素化与降解。Iκ-Bα降解可导致活化单位的p50、p65的释放并结合到细胞核,结合到特定的启动子区域,编码炎症细胞因子。另外,熊果酸可明显抑制新生血管的生成,减轻免疫排斥的炎症反应；降低由CD3/CD8诱导的T细胞表面标志CD25、CD69与IL-2的表达含量,抑制NF-κB核因子转录与T细胞活性,而非通过上调CD4 CD25 Foxp3T细胞,诱导宿主的特异性免疫耐受；能够抑制B细胞、T细胞、巨噬细胞的活化,增殖与细胞因子的分泌。抑制丝裂霉素诱导的ERK、JNK的磷酸化与免疫调节转录因子NF-κB、 NF-AT与AP-1的活化,明显降低IL-2、IL-4、IL-6及IL-17的含量,降低T细胞表面CD25、CD69、CD134、CD80及CD86的含量；呈剂量依赖性地抑制T细胞的活化与增殖,能够明显降低T细胞表面活性标志CD25、CD69与CD71的含量,降低NF-κB的表达,从而抑制T细胞活性。因此,本实验拟应用“熊果酸抑制NF-κB的活性,延长角膜移植存活时间”方案,经腹腔内注射至同种异体大鼠角膜移植模型(SD→Wistar)的受体体内,探讨熊果酸对诱导角膜移植免疫耐受的影响,为临床进行有效治疗、抑制角膜移植术后的排斥反应提供重要的理论依据。材料与方法1、实验动物供体为SD大鼠；受体为Wistar大鼠。鼠龄6-8周,体重180-220g,雌性。分4组：A：空白对照组(n=8)；B：自体角膜移植组(n=8)；C：同种异体角膜移植组；D：熊果酸组(n=8),建立大鼠同种异体角膜移植模型,术后观察角膜移植排斥反应及按Larkin等人评分标准评分,术后14天取材。2、病理组织切片HE染色术后第14天,分别于各组中取大鼠角膜植片进行组织病理学检测,标本经4%多聚甲醛溶液固定、脱水、常规石蜡包埋,制备成5μm厚的连续切片,经苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察角膜植片病理学变化。3、Real Time PCR (RT-PCR)检测取大鼠角膜,置于1mL Trizol的离心管中,采用Trizol一步法提取总RNA,行琼脂糖凝胶电泳检测；以焦碳酸二乙酯(DEPC)水为空白对照,应用Nanodrop测定RNA浓度,同时记录各组的RNA浓度及其OD260/OD280值；按照逆转录试剂盒的说明书,逆转录反应合成cDNA。提取的DNA样品直接用于qPCR实验或者-20℃保存。引物序列为：GAPDH上游：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’下游：5’-TCCACCACCCT GTTGCTGAT-3’IL-2上游：5’-TGATGGACCTACAGGAGCTCCTGAG-3’下游：5’-GAGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3’VEGF上游:5’-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3’下游：5’-TGAACTTCACCACTTGGCAT-3’IFN-γ上游:5’-GGAGGAACTGGCAAAAGGATGGT-3’下游：5’-TTGGGACAATCTCTTCCCCAC-3’ICAM-1上游：5’-GCTACATCCACACTGACGCT-3’下游：5’-CAGGGAATGAGTAGACCTCCA-3’NF-KBp65上游：5’-CCGTGGAGTACGACAACATC-3’下游：5’-CCTCTTCCAGCTGCTATGTG-3’RT-PCR反应体系如下：反应总体积(Total)为20μl:SYBR@ (R) PrimxEx Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2x) 10.0μl, PCR Forward Prime (10μM) 0.8μl、PCR Reverse orword Prime (10μM) 0.8μl、ROX reference Dye (50x)、DNA模板2μ1、dH2O(灭菌蒸馏水)6μ1。反应条件：95℃30s预变性,95℃5s,60℃34s,40个循环,重复3次。4、Western Blotting检测取大鼠角膜植片,采用冰冻的RIPA裂解液裂解角膜组织,PBS缓冲液进行洗涤,加入蛋白酶抑制剂,提取核蛋白；SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离,转移至硝酸纤维素膜；室温下用封闭液(5%脱脂奶)封闭1h；兔抗NF-κBp65多克隆抗体、兔抗IκB-α多克隆抗体(1：4000),鼠抗ICAM-1单克隆抗体4℃孵育过夜；洗涤与封闭后,与相应的Ⅱ抗(1：10000)结合,定影、显影、曝光,化学发光法显示免疫条带。GAPDH作为内参抗体。采用凝胶成像分析系统对条带进行定量分析。5、统计学分析方法应用SPSS 16.0统计软件,对实验数据进行分析处理。应用Kaplan-Meier检验比较各组植片的平均存活时间。实验数据采用x±s表示,所有数据进行方差齐性检验后,采用单因素方差分析及两样本均数比较的t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.与同种异体角膜移植组相比,熊果酸组的角膜植片存活时间明显延长,P<0.05,两组间的差异有统计学意义。2.各组(正常对照组、自体角膜移植组、同种异体角膜移植组及熊果酸组)取眼球组织行病理组织切片检查,结果显示：正常角膜组织结果清楚,未见异常；自体角膜移植组中角膜各层结构清楚,未见明显异常,仅基质层中见少量新生血管与炎性细胞浸润；同种异体角膜移植组角膜各层组织中大量单核巨噬细胞及淋巴细胞浸润,基质层可见新生血管形成,部分新生血管的管腔中亦可见散在的少量淋巴细胞；熊果酸组的角膜结构基本保持正常,植片基质层仅有个别淋巴细胞浸润,植床处可见少量新生血管。3.各组(正常对照组、自体角膜移植组、同种异体角膜移植组及熊果酸组)取角膜移植片行RT-PCR检测,各组角膜植片中NF-KBp65, IL-2, VEGF, IFN-y, ICAM-1的相对含量(RQ值表示)在mRNA水平上有差异,B组、C组在角膜移植术后,IL-2, IFN-γ, NF-κBp65, VEGF, ICAM-1的含量会明显升高,D组,即熊果酸组,用药之后,相应的炎症指标明显下降。应用单因素方差分析,先进行方差齐性检验,F值依次为236.991,414.224,24.931,32.164,21.383,采用LSD检验进行两两比较,正常组与自体角膜移植组之间的差异无统计学意义；C组与D组之间,NF-κBp65的相对含量差异无统计学意义(P>0.05),其余各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。4.各组(正常对照组、自体角膜移植组、同种异体角膜移植组及熊果酸组)取角膜移植片行Western Blotting检测,各组角膜植片中NF-κBp65,IκB-α的相对含量(用1A表示)在蛋白表达水平上有所差异,自体角膜移植组、熊果酸组在角膜移植术后,NF-κBp65,κB-α的相对含量变化趋势一致；与同种异体角膜移植组相比,熊果酸组NF-κBp65的相对含量明显下降,而κB-α的含量升高。结论1.同种异体大鼠角膜移植术后,熊果酸组角膜植片的存活时间明显延长；病理组织切片显示：熊果酸组的淋巴细胞浸润与新生血管情况,均较同种异体角膜移植组明显好转；说明熊果酸对移植术后排斥反应具有一定的抑制作用。2.RT-PCR检测结果显示：在mRNA水平上,各组角膜植片中IL-2、IFN-γ、 NF-κBp65、VEGF、ICAM-1的相对含量有差异,用药之后,相应的炎症指标明显下降；Western Blotting检测结果表明,熊果酸组NF-KBp65的相对含量明显下降,而κ-Bα的含量升高,熊果酸可能通过抑制NF-κB通道蛋白的表达,抑制角膜移植排斥反应的。因此,本实验为熊果酸的临床应用提供实验依据。