随着人类基因组计划的完成，以DNA芯片技术为代表的生物芯片技术已经成为结构和功能基因组学研究的主要手段之一。目前，凡是涉及到基因组核酸结构和表达的领域都已经“芯片化”，如：比较基因组学研究、基因组测序、基因组SNP多态性分析、甲基化研究、mRNA表达谱分析、表达谱诊断、转录启动子分析、RNA拼接研究、microRNA研究等。 病毒学是最早成为广泛开展结构和功能基因组学研究的领域。至今，已经测定全基因组序列的病毒种类达1757种。DNA芯片技术在病毒结构和功能基因组学研究中的主要应用包括：(1)采用DNA芯片鉴定和研究病毒基因组的结构和功能，如：病毒转录组、多态性分析、病毒株变异分析和临床鉴定分型等；(2)病毒感染宿主细胞的基因表达谱分析；(3)基因敲除与DNA芯片相结合的方法，研究与病毒致病性相关基因的功能。 本研究内容分为三个部分：(1)研究DNA芯片样本标记方法，这些样本标记方法可能在DNA表达谱芯片和病毒诊断芯片领域均有广泛的应用前景；(2)以风疹病毒(Rubellavirus，RV)为研究对象，研究RV感染ECV304血管内皮样细胞的细胞病变特征；(3)采用基因芯片来鉴定RV感染ECV304细胞的基因组基因表达谱变化。 (一)样本标记方法对60-mer寡核苷酸芯片荧光信号强度的影响研究 目的：DNA芯片实验是一个受多种因素影响的过程，每一个步骤都是杂交信号强度变异的潜在因素，其变异来源可分为三大类：生物因素变异、技术因素变异和随机误差。样本标记方法是其中最重要的技术变异因素之一。我们首先初步研究基于限制性显示技术的Cy-dUTP掺入cDNA标记法(Cy-dUTPincorporatedcDNAlabellingwithrestrictiondisplay，IL-RD)作为一种长链寡核苷酸芯片样本标记方法对芯片杂交信号的影响，然后采用自制的长链寡核苷酸芯片来比较IL-RD、基于限制性显示技术的cDNA直接标记法(directcDNAlabellingwithrestrictiondisplay，DL-RD)、通用引物cDNA标记法(universalprimerlabeling，UPL)和传统cDNA直接标记法(directcDNAlabeling，DL)间芯片荧光信号强度的差异。 方法：收集3个健康人外周血单核细胞，提取RNA后分为两组，采用IL-RD进行样本双色(Cy3/Cy5)荧光标记，与3张Agilent60-mer人寡核苷酸芯片进行杂交，排除阴性和阳性对照信号值、Cy3和(或)Cy5荧光素的前景信号与背景信号间无统计显著性差异点的信号值，进一步排除两种荧光标记间存在统计显著性差异点的信号值，将3张芯片的共同信号值用于分析。SPSS软件进行常规统计分析和作图，R语言环境下的VSN统计包排除芯片间和两种不同荧光标记间的系统误差。样本标记方法间的比较采用自制60-mer长链寡核苷酸芯片，以80条人流感特异性探针设计成15×16点阵，实验室培养人流感病毒株系阳性样本，然后分别采用IL-RD、DL-RD、UPL和DL方法进行单色荧光标记，每种方法标记后的样本进行5次芯片重复杂交试验，筛选前景信号高于背景信号两个标准差的探针进行统计分析，非参数检验Kruskal-Wallis法和单向方差分析(one-wayANOVA)来比较不同标记方法间探针背景信号强度和探针与样本杂交信号强度的差异。 结果：3张芯片的8,744个共同点用于研究，芯片间及两种荧光标记方法间存在明显的可校正的系统误差，芯片间杂交信号值相关显著，IL-RD样本标记方法对较低表达丰度基因较为敏感。标记方法间60-mer长链寡核苷酸芯片背景和探针信号强度存在显著性差异(P＜0.001)。 结论：初步的统计分析结果表明，IL-RD是一种潜在的实用的长链寡核苷酸芯片样本标记方法。标记方法间的比较表明，IL-RD样本标记方法是标记效率最高的一种方法，标记过程中的几个关键性因素可能对长链寡核苷酸芯片的荧光信号强度产生很大影响，这些因素包括：样本的扩增策略、标记过程中荧光素标记的方式和序列依赖性效率、限制性内切酶消化产生的片段大小。 (二)风疹病毒感染ECV304血管内皮样细胞的细胞病变效应 目的：孕妇在怀孕早期(怀孕开始三月内)感染RV，可引起80-90％死胎、流产或先天性风疹综合征(congenitalrubellasyndrome，CRS)婴儿出生，是先天性致畸的主要原因之一。目前，RV致畸的细胞和分子机理尚不清楚。在我国，RV基础研究薄弱。本研究通过体外培养和RV野生株感染ECV304血管内皮样细胞，初步探讨中国大陆流行的风疹病毒野生株的致病变性特征。 方法：常规方法培养ECV304血管内皮样细胞和病毒接种，RT-PCR和间接免疫荧光法检测RV包膜糖蛋白E1基因的表达，相差显微镜及电子显微镜下观察细胞受病毒感染后形态变化，DNA片断化检测(DNALadder)法和脱氧核糖核酸末端转移酶法(TUNEL)检测细胞凋亡。 结果：感染后2-3天即可检测到RV包膜糖蛋白E1基因表达；感染后4天，相差显微镜观察呈现明显的细胞病变效应，即：细胞悬浮脱壁、胞体变圆缩小、胞膜皱缩、染色质浓缩等；电镜下观察可见明显病毒颗粒，核染色质浓集、边缘化，线粒体聚集于胞核周围呈溶酶体化、空泡化和自噬现象。TUNEL法检测细胞凋亡指数(apoptosisindex，AI)在病毒感染组与对照组间有显著性差异(t=-5.8，P＜0.001)。 结论：RV野生株在ECV304血管内皮样细胞中有明显的致细胞病变效应，在体外细胞培养下可诱导ECV304血管内皮样细胞凋亡。大陆流行的RV野生株的细胞致病性特征与以往的研究结果基本一致。 (三)风疹病毒感染ECV304血管内皮样细胞的基因组表达谱研究 目的：病毒感染宿主细胞引起的宿主细胞基因表达谱变化研究已取得极大进展，现有关于RV致病机理的研究结果尚无法从整体上揭示病毒与宿主细胞间的相互作用。本研究使用高密度寡核苷酸表达谱芯片平台来筛选RV感染ECV304细胞与其对照间的差异表达基因，然后对所得到的差异表达基因进行相关的生物信息学分析，从整体上揭示RV致畸的可能的分子机制。 方法：收集感染RV4天后的ECV304血管内皮样细胞及其对照细胞，Trizol法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪测定RNA样本浓度和纯度，cRNA线性扩增标记法进行双色荧光标记，标记样本与Agilent公司G4110BHuman1A(V2)Oligo芯片杂交，采用Agilent2565BA基因芯片扫描仪进行图像扫描，AgilentG2567AAFeatureExtraction软件筛选差异表达基因，Onto-Express(OE)进行GeneOntology(GO)定义的细胞分子生物过程分析，AnnotationDatabase软件对筛选得到的显著性生物过程基因进行功能注解与分析，实时荧光定量RT-PCR验证芯片结果。 结果：共筛选得到差异表达基因487个，其中上调表达基因456个，下调表达基因31个。生物过程分析的结果表明，RV感染ECV304血管内皮样细胞4天后，差异表达基因有关的生物过程共243个，其中显著性相关生物过程53个，在显著性相关的生物过程中，其中52个过程均只包括1个基因，而有1个过程病毒反应过程包括5个基因。所选取的基因实时荧光定量RT-PCR相对定量的结果和芯片检测的结果基本趋势一致，表明芯片表达谱分析的结果有很高的可靠性。 结论：基因组表达谱分析的结果表明，一些宿主细胞基因表达产物及分子生物过程可能与RV致病机理有关，包括：参与病毒反应过程的ISG20、OTK18、IFNA21、TRIM22、MX2基因；与有丝分裂细胞周期G1相关的GFI1B基因；参与细胞周期素分解代谢相关的UBE2C基因；参与中心体周期的CETN3基因；参与细胞周期素依赖的蛋白激酶活性的负调节的HIS1基因；与线粒体相关的Grx2基因；与衰老过程相关的WRN基因。 综上所述，本研究将IL-RD法进一步扩展到了表达谱芯片领域，研究结果表明IL-RD样本标记方法是标记效率最高的一种方法。风疹病毒的野生株具致ECV304细胞病变的效应，可诱导细胞凋亡。基因组表达谱研究结果提示一些参与病毒反应过程的基因与分子过程可能与RV致病机理有关。