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节旋藻(Arthrospira)被世界粮农组织誉为21世纪人类最理想的食品,上世纪80年代已经实现工业化养殖。进一步改良藻种种质,获得在工业生产上具有优良性状的突变株,并深入了解与节旋藻光合作用密切相关的二氧化碳浓缩机制对于节旋藻养殖有着重要的意义。
节旋藻正常生长需要氮源和碳源,而适宜浓度的NH4HCO3可以同时为藻体提供氮源和碳源。而且利用氨水吸收工业废气中的CO2是新的发展趋势,有效的利用NH4HCO3对于节能减排有重要意义。高浓度的NH4+还可以在节旋藻大规模养殖中对于原生动物有杀灭作用。但是高浓度的NH4+对于正常生长的藻体也会有伤害,因此有必要筛选能够在高浓度NH4HCO3下可以生长的钝顶节旋藻。
节旋藻的二氧化碳浓缩机制(CCM)在固碳过程中起着重要的作用。羧酶体是CCM机制的主要元件,ccmM及ccmO编码了羧酶体包被蛋白相关基因:且CCM机制的关键酶之一-碳酸酐酶现在还未有报道,而ccmM基因编码的蛋白其N-末端结构域与γ-碳酸酐酶相似。因此本论文还试图通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)手段了解ccmM及ccmO基因的表达特性,以了解钝顶节旋藻CCM机制的表达情况。
本论文首先比较了紫外线、EMS、NTG三种不同诱变剂对于钝顶节旋藻的诱变效果,选择了NTG作为最适宜的诱变剂诱导钝顶节旋藻发生突变。在0.022mol/1NH4HCO3的选择压下,筛选得到了8株能够耐受高浓度NH4HCO3突变株。并比较了诱变前后藻株在高浓度NH4HCO3条件下的生长速率及光合速率。
结果表明,0.004mol/l的NH4HCO3最有利于出发藻株的生长,在NH4HCO3浓度为0.022mol/l时达到出发株的耐受极限。在8株突变株中有5株突变株对于NH4HCO3的耐受性与出发藻株有显著性差异。
比较0.022mol/l NH4HCO3下各突变株的比生长速率,可以知道2号突变株在0.004mol/l NH4+浓度时,比生长速率较出发藻株提高了29.3%,5、6、8号突变株在400mg/l NH4+浓度时,比生长速率为正值,而同样处理条件下出发株的比生长速率为负值。说明在此浓度的选择压下,突变株可以存活而出发株不能存活。
比较0.022mol/l NH4HCO3下各突变株的光合速率,发现2号突变株的最大净光合速率在0.004mol/l NH4+浓度时出现,为3.066×10-4nmol·h-1·cell-1,比出发藻株提高了14.8%,在160mg/lNH4+浓度时2号突变株的净光合速率比出发藻株提高了93.7%。4、5、6、8号突变株的最大净光合速率都在0.008mol/l NH4+浓度时出现,分别为2.883×10-4nmol·h-1·cell-1、3.027×10-4nmol·h-1·cell-1、2.969×10-4nmol·h-1·cell-1、3.310×10-4nmol·h-1·cell-1,比出发藻株分别提高了91.4%、101.00%、97.1%和119.79%。用生长曲线检验发现这5株突变株有着优良的遗传稳定性。
另一方面,本论文还用2%CO2通气培养钝顶节旋藻48hrs抑制CCM相关的诱导型基因的表达,再通入含有低浓度CO2的空气以诱导CCM相关的诱导型基因的表达。通过测定低碳诱导后钝顶节旋藻光合效率变化情况确定CCM机制的作用情况;通过RT-PCR手段,研究低碳诱导后钝顶节旋藻CCM机制相关的ccmM、ccmO基因的表达情况。
结果表明,钝顶节旋藻经低碳诱导后,光合效率有所降低,并在低碳诱导30min后光合效率达到稳定,说明低碳诱导30min后CCM机制就已经稳定发挥作用;通过RT-PCR手段,我们发现经过低碳诱导以后,ccmM、ccmO基因的表达没有显著性变化,说明钝顶节旋藻CCM机制在经过短时间的低碳诱导以后,羧酶体的数目没有显著变化,且ccmM基因编码的蛋白在藻体内可能并不能起到碳酸酐酶的作用,在钝顶节旋藻藻体内可能还有另外的未发现的碳酸酐酶存在。
综上所述,本论文证明通过诱变剂诱发节旋藻的基因突变,并加以适当的选择,这在选育节旋藻优良品种方面是可以大有作为的;并证明了钝顶节旋藻在经过短时间的低碳诱导以后,羧酶体的数目没有显著变化,且ccmM基因编码的蛋白在藻体内并不能起到碳酸酐酶的作用。