异源表达毛束霉菌TrGDH对水稻氮素利用及产量的影响

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谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)在高等植物体内普遍存在,但由于高等植物GDHs对NH4+的亲和力较低,而微生物GDHs对NH4+的亲和力普遍高于高等植物,因此在高等植物中异源表达微生物GDHs有望改善甚至提高其氮素利用效率。基于近年研究近况,从真菌毛束霉菌(Trichurus)克隆得到其GDH基因,即本研究的目的基因TrGDH,并将其转入水稻(Oryza sativa cv.Kitaake)中,对其影响水稻的氮素利用及产量进行相关研究。(1)从毛束霉菌(Trichurus)中克隆了一个新的NADP(H)-GDH基因TrGDH,其编码序列(CDS)全长1359 bp,编码452个氨基酸。氨基酸结构域分析发现,TrGDH含有2个关键结构域:NADP(H)结合结构域和α-酮戊二酸(2-OG)结合结构域。对TrGDH和其他33个不同来源的GDHs进行了生物进化树分析,结果显示TrGDH与毛壳菌(Chaetomium globosum)及粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)处于进化树同一分支,亲源关系较近;与水稻和拟南芥等高等植物处在不同分支,亲源关系较远。(2)将Tr GDH原核表达纯化蛋白,重组蛋白大小为104 kD,并进行体外酶活测定,发现与水稻Os GDH4相比,His-TF-Tr GDH对NH4+(Km=1.48±0.11 mM)表现出更高的亲和力,催化反应向生成谷氨酸的方向进行。(3)通过构建TrGDH植物过表达载体,即pCAMBIA1301GW-TrGDH,并经农杆菌介导转入水稻。植物体内NH4+同化速率测定发现Ubi::TrGDH转基因植株的NADP(H)-GDH活性明显高于对照组。并通过qRT-PCR实验分析,发现TrGDH转入水稻在一定程度上竞争性抑制了水稻内源GDHs的表达。(4)设置氮胁迫水培实验,分别测定Ubi::TrGDH转基因植株的鲜重、干重和含氮量,与对照组相比发现均显著增加。大田实验进一步证明,转基因植株的有效穗、千粒重和单株产量均显著高于对照组,尤其在低氮条件下。此外,对Ubi::TrGDH转基因植株的种子的蛋白测定发现,与对照组相比,显著提高了谷蛋白和谷醇溶蛋白含量,表明转基因植株稻谷的营养品质得到了提升。综上来看,这些结果充分证明了TrGDH在水稻中的异源表达可以通过提高氮素利用率来改善植株的生长状态和单株产量。因此,本研究为TrGDH有期在未来成为通过基因工程提升作物产量的候选基因提供了理论和实验依据。
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