论文部分内容阅读
MHC分子识别病毒来源的T细胞多肽，然后形成多肽-MHC分子复合物，将抗原肽信号呈递给T细胞表面的T细胞受体，是细胞免疫在病毒清除过程中发挥作用的非常关键的一个步骤。此外，T细胞的免疫应答还需要T细胞表面共刺激分子和共抑制分子的调控，才能在抗原清除过程中很好的发挥作用。 已经有研究表明，抗原肽可以通过调节MHC-I类分子的构象来将抗原肽信号呈递给T细胞，进而影响T细胞的免疫应答，但MHC-I类分子通过自身的构象改变是否会影响机体通过T细胞特异性免疫应答来清除病毒依然没有报道。因此本文的研究中，我们首先通过中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的小鼠模型，发现因受到一条CD8+T细胞特异性多肽的一个特殊的次级锚定残基Ile5的影响，MHC-I类分子H-2Kd的α1结构域上的Trp73的构象发生了变化。通过体外复性实验和圆二色谱实验我们发现多肽H-2Kd的亲和力不受该构象改变的影响。但是当我们把这个次级锚定残基（多肽第五位氨基酸）Ile突变为Ala以后，通过动物实验和体外的四聚体染色、ELISPOT实验、细胞内因子染色实验等，我们发现突变后的多肽在T细胞识别以及在机体中刺激T细胞产生免疫应答发挥免疫保护的能力均比野生型弱。我们的研究发现了机体中，通过多肽MHC分子相互作用激活T细胞产生免疫应答过程的一个新的MHC分子呈递机制，为病毒T细胞疫苗的研发提供了很好的参考。 通过筛选免疫检查点，特别是以PD-1/PD-L1为靶点的单克隆抗体来治疗肿瘤是目前肿瘤免疫治疗的一大热点。目前，已经有很多以PD-1/PD-L1为靶点的单克隆抗体进入临床III期实验或者被FDA批准（如：nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab和BMS-936559等）。人的PD-L1单体结构、鼠的PD-1（mPD-1）与人的PD-L1（hPD-L1）复合物结构以及人的PD-1(hPD-1)与hPD-L1复合物结构已经被解析，hPD-1与其治疗性单克隆抗体pembrolizumab的复合物结构也已经被解析，但是hPD-L1与其治疗性单克隆抗体的复合物结构还没有人解析。在本文的研究中，我们在体外用E. coli表达系统表达目的蛋白的方法获得hPD-L1的治疗性单克隆抗体avelumab的scFv（single chain Fv fragment）的包涵体和hPD-L1的包涵体，然后用体外复性的方法分别拿到了avelumab-scFv和hPD-L1的可溶性蛋白，用SPR（surface plasmon resonance）的方法测定两者的亲和力为42.1 pM，hPD-L1与avelumab-scFv高亲和力的结合是其发挥治疗作用的一个重要机制。然后把这两种蛋白按照一定比例混合后纯化拿到了avelumab-scFv/hPD-L1复合物，筛选晶体，我们拿到了3.2?的复合物结构。从结构中我们发现，治疗性单克隆抗体 avelumab与 hPD-L1分子的结合面跟hPD-1/hPD-L1复合物的结合面有很大面积重叠，avelumab通过空间位阻阻断hPD-1与hPD-L1的结合。另外我们发现hPD-L1分子的F和G折叠片是抗PD-L1治疗性单克隆抗体阻断hPD-1与hPD-L1的结合的很好位点。我们的发现为设计和筛选hPD-L1的治疗性抗体提供了参考。 简而言之，通过结构免疫学，我们在MERS-CoV病毒易感小鼠模型中发现了MHC-I类分子在呈递抗原肽过程中的一个新的呈递机制并用动物实验和细胞实验验证这种在多肽参与下的H-2Kd分子构象的改变在机体中发挥免疫保护作用。为病毒T细胞疫苗的研发提供了很好的参考。通过对PD-L1与治疗性单克隆抗体的复合物结构的解析，我们阐明了抗体Avelumab阻断PD-1/PD-L1的分子机制，为肿瘤免疫治疗中新的抗体筛选和小分子药物研发提供了理论依据。