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青鱼（Mylopharyngodon piceus）是我国传统的“四大家鱼”之一,是我国重要的经济鱼种,是淡水鱼类中体型较大,繁殖周期较长的品种。受人工繁殖的影响,近年来出现了种质资源退化、病害增多、养殖效益下降的趋势。青鱼种质的鉴定、分离和保存不仅可以保护优质的青鱼种质资源,也能为大型淡水鱼种的种质资源保存提供借鉴,甚至可以借助借腹怀胎的方式缩短青鱼的繁殖周期。而生殖细胞标记基因的分离和鉴定是实现青鱼种质保存的第一步。Vasa是常用的生殖细胞尤其是原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）的标记因子,广泛用于PGCs起源、迁移、分化的观察以及性腺发生、配子发生等的研究。本研究克隆了青鱼vasa基因并分析了其在青鱼组织和细胞中的表达,结果表明vasa主要在青鱼生殖细胞中表达。并且利用vasa原位杂交观察到了青鱼PGCs的起源、迁移和定位。通过显微注射vasa3’UTR融合荧光蛋白和vasa 5’转录调控序列调控荧光蛋白的转基因质粒发现vasa转录调控序列可以标记斑马鱼和青鳉PGCs。另外,建立了2种表达nanog、oct4两种干细胞相关基因和vasa的青鱼体细胞系,在断裂修复的青鳉新生尾鳍中也检测到了vasa m RNA的表达,证明了vasa或许也可以在鱼类生殖细胞外的成体干细胞中表达。主要结果如下:1)通过RACE技术获得了全长2972 bp的青鱼vasa c DNA序列,分析了其核酸及蛋白序列结构,比较了其与其他物种Vasa的相似性和同源性,与草鱼、斑马鱼、青鳉、爪蟾、人、鼠和果蝇的相似度分别为87%、78%、58%、47%、51%、52%和38%。进化树分析表明其属于DEAD-box家族的VASA亚家族,与鲤科鱼类Vasa处于同一分支。根据斑马鱼vasa基因组结构预测了其外显子的位置,结果表明含有25个外显子。2)通过半定量PCR（semi-quantitative PCR,sq PCR）,荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR）和western blot发现vasa仅在性腺中表达,原位杂交和免疫组化结果进一步发现其仅在卵巢的卵母细胞和滤泡细胞中表达,并且在早期卵母细胞中的表达量较高,其主要集中在I、II和III期母细胞中,随着卵母细胞发育表达逐渐降低,在VI期及V期的卵母细胞中表达较弱。q RT-PCR和western blot显示在vasa胚胎发育过程中持续表达,整胚原位杂交发现vasa在青鱼胚胎发育早期定位于卵裂沟末端,随着胚胎发育迁移到对称的4簇细胞中,到原肠期vasa阳性细胞开始向胚胎背部迁移并最终定位与生殖嵴。青鱼vasa m RNA的这种动态表达模式与其他鱼类vasa标记的PGCs的迁移模式十分相似,表明我们分离得到的是青鱼vasa同源基因基因,并且其可以作为生殖细胞标记基因使用,是青鱼中分离得到的首个生殖细胞标记基因。局部放大的出膜期原位杂交结果和亚细胞定位结果均显示vasa主要表达在细胞质中。未受精卵的结果给出了vasa作为母源因子的最直接的证据,在未受精卵中vasa m RNA和蛋白都能检测到,而且原位杂交结果显示在未受精的情况下,vasa m RNA也如受精卵中一致可以进行准确的定位,分布于卵裂沟的边缘。3)利用青鱼vasa生殖细胞特异性标记的特点,构建了vasa 3’UTR和荧光蛋白融合表达质粒p C-Cherry-Mpvs3U,将体外转录合成的Cherry-Mpvasa 3’UTR m RNA显微注射至斑马鱼或青鳉的1细胞胚胎,发现其可以快速对斑马鱼和青鳉的PGCs进行标记。通过Tail-PCR技术克隆得到了3157 bp的青鱼vasa 5’转录调控序列,构建了p Mpvs P-Cherry-3U转基因质粒,通过显微注射发现其也可以标记斑马鱼PGCs。重新将青鱼转录调控序列调控的荧光和抗性双标记基因构建到SB转座子系统中,构建了p T2/BH Mpvs P-Pac Red-3UTR转基因质粒,将其显微注射到青鳉中获得了Mpvasapromoter-Pac Red-3UTR嵌合到染色体的转基因青鳉。4)建立了青鱼鳔和肾脏2种细胞系（MPB和MPK）,并对其冻存复苏能力、最适生长条件、染色体众数和核型、细胞来源等基本生物学特征进行了分析和鉴定条件,然后对其SVCV敏感度和转染效率进行了测定。结果发现,MPB和MPK的适宜的生长温度为28-32℃,最适基础培养基为DMEM,最佳的血清添加量为10%,染色体众数为48,16s r RNA序列分析表明这2种细胞来源于青鱼。MPB对SVCV不敏感,MPK对SVCV较敏感,可以在MPK中大量扩增,并出现显著的病变。MPB的脂质体转染和电转效率较高,分别为21%和34%,MPK的脂质体转染和电转效率稍低,分别为10%和18%。经检测在这2种细胞系中均有vasa的表达,同时还可以检测到干细胞因子nanog和oct4的表达,表明建立的2种青鱼细胞系或许是青鱼鳔和肾脏的成体干细胞系。我们在再生青鳉鳍条组织中也检测到了vasa m RNA的表达。因此vasa在MPK、MPB以及再生鳍条中的表达表明vasa或许可以在鱼类生殖细胞以外的成体干细胞中表达并发挥作用。MPB中存在3种vasa可变剪接体,MPK中存在2种vasa可变剪接体,这种不同的剪接体在青鱼细胞系中发挥何种作用,是否与其在成体干细胞中的表达有关,还有待进一步考察。综上所述,我们获得了青鱼中首个生殖细胞标记基因vasa,并利用其对生殖细胞的标记功能对斑马鱼和青鳉的PGCs进行了标记,并且获得vasa表达的青鱼细胞系。