心血管疾病是全世界发病率和死亡率最高的疾病之一。心力衰竭是指心脏不能充分泵送足以维持外周组织代谢需求的血量,从而引起心脏循环障碍的心脏疾病。心力衰竭通常是由缺血性心脏病、高血压或瓣膜性心脏病引起的,其发生发展中伴随着氧化应激及细胞凋亡,新近研究表明miRNA在心力衰竭等心血管疾病中扮演着重要角色。高血压及缺血性心脏病所引起的心力衰竭只能通过药物等治疗方式进行减缓,而无法逆转。因此,研究有效的心脏保护策略意义重大。越来越多的研究证实了运动训练不仅能降低心血管疾病风险,而且具有直接的心脏保护作用。有氧运动可以延缓心力衰竭的发生发展,但具体机制仍然不明确。本研究中,我们重点探讨有氧运动对引起心力衰竭的两大病因——高血压和缺血性心脏病——的影响及其机制,主要从氧化应激和miRNA入手,拟通过深入研究,揭示有氧运动对心力衰竭的心脏保护作用及机制,为运动裨益心脏健康提供实验依据。研究目的:（1）采用自发性高血压大鼠（SHR）进行运动,明确有氧运动对氧化应激的影响在高血压的心脏保护中的作用及其机制。（2）对心肌梗死（MI）小鼠进行运动,明确有氧运动对心肌梗死的心脏保护作用与何种miRNA相关并探讨其机制。研究方法:1.采用自发性高血压大鼠及与其年龄配对的Wistar-Kyoto（WKY）大鼠,进行为期16周的中等强度运动,研究有氧运动对高血压心脏保护的作用及机制。（1）实验动物及分组:八周龄雄性自发性高血压大鼠和对照组WKY大鼠均购自维通利华公司（中国）并饲养于中国人民解放军第四军医大学动物中心。将自发性高血压大鼠和对照组WKY大鼠分别分成两组,运动组（SHR+Exe组、WKY+Exe组）和安静组（SHR+Sed组、WKY+Sed组）,每组8只。运动组大鼠每天以20 m/min的速度在马达驱动的跑步机上跑步1h,5 d/wk,为期16 wk,安静组不进行任何运动。（2）血压、血流动力学指标及肠系膜血管舒张功能检测:每四周采用尾动脉加压法检测大鼠血压;末次运动后24 h,采用多道生理记录仪检测大鼠血流动力学指标;分离大鼠肠系膜动脉,采用血管张力测定仪,分别加入不同浓度的乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）观察血管的内皮依赖性和非内皮依赖性舒张反应。（3）心肌线粒体超微结构、活性氧（ROS）水平、谷胱甘肽含量以及超氧化物歧化酶2（SOD2）活性检测:透射电子显微镜对处理过的心肌样品进行观察,并使用Gatan数字显微镜拍摄心肌线粒体显微照片;采用对氧化敏感的荧光染料二氢乙基（DHE）进行ROS含量的原位评估;采用专门的试剂盒测定还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量;采用水溶性四唑盐法检测SOD2活性。（4）肠系膜血管谷氧还蛋白]（Grx-1）、心肌沉默调节蛋白3（SIRT3）、SOD2蛋白水平检测:常规免疫印迹法检测肠系膜血管Grx-1、心肌SIRT3、SOD2蛋白水平。2.建立小鼠心肌梗死模型,进行游泳运动4周,研究有氧运动对心肌梗死的心脏保护作用及机制。（1）实验动物模型建立及运动干预:雄性C57/BL6小鼠（8周龄）购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心。所有手术程序和动物关怀规程均经动物关怀和使用委员会批准。利用左冠状动脉前降支结扎法制备心肌梗死模型,术后24 h,给予运动组小鼠每天适应性游泳训练5 min,在之后的一周时间内逐渐增加至60 min,运动持续时间4 wk,5 d/wk。（2）心功能、心肌组织细胞凋亡检测:Miller导管检测以获取血流动力学数据,小动物心脏超声仪测定实验小鼠心脏形态及功能;心肌细胞凋亡通过TUNEL染色来评价。（3）心肌组织中miRNAs差异表达确定及特定miRNAs水平检测:采用Illumina Hiseq 2500平台进行miRNA高通量测序技术分析运动组和安静组小鼠心肌组织中miRNAs的表达差异;采用实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测小鼠心肌组织中特定miRNA的水平。（4）在体和细胞水平上调或下调特定miRNA水平方法:体内验证工作采用心肌内点注射特定miRNA的Agomir和Antagomir来模拟特定miRNA的上调和下调;细胞水平采用特定miRNA的模拟物mimic来进一步确定特定靶基因的靶点。（5）特定miRNA靶基因的确定:采用双重荧光素酶报告基因系统和免疫印迹技术确定特定miRNA靶基因。研究结果:1.16周中等强度运动通过氧化还原稳态和SIRT3/SOD2信号通路改善自发性高血压大鼠心脏功能。（1）16周中等强度运动显著降低高血压大鼠的舒张压和收缩压;显著降低左室收缩末压（LVSP）（p<0.01）,显著升高左室压力最大上升速率（+LVdP/dtmax）（p<0.01）和左室压力最大下降速率（-LVdP/dtmax）（p<0.05）。说明运动显著改善了 SHR的心脏收缩和舒张功能。（2）经过16周中等强度运动之后,运动组ACh引起的内皮依赖性舒张作用明显高于安静组（p<0.01）,SNP引起的非内皮依赖性血管舒张作用未见明显改变。说明运动可以改善高血压引起的血管内皮功能障碍。（3）16周中等强度运动显著改善高血压大鼠心肌线粒体排列散乱、形态改变、出现不同程度肿胀的现象,说明运动能够改善高血压对心肌线粒体的损伤;16周中等强度运动使对照组和高血压大鼠心肌组织中ROS水平显著降低（p<0.01）。说明不管是正常大鼠还是自发性高血压大鼠,中等强度运动都能显著降低心肌组织中的活性氧水平。（4）16周中等强度运动降低肠系膜血管组织ROS水平、增加Grx-1表达,说明运动可改善肠系膜血管组织中氧化还原状态;并且增加心肌组织GSH表达量,降低GSSG含量,说明运动可通过增加心肌组织中还原型谷胱甘肽的含量进而增强其清除活性氧的能力。（5）16周中等强度运动使得自发性高血压大鼠心肌中SIRT3和SOD2的表达水平进一步升高（p<0.001）,同时心肌组织中的SOD2活性水平也得以进一步增加,说明运动可以上调SIRT3/SOD2信号通路,进而改善自发性高血压大鼠心脏功能。2.4周游泳运动通过增加循环miR-1192水平发挥对心肌梗死的心脏保护作用（1）4周游泳运动可显著改善小鼠心肌梗死后生存率;与心肌梗死组小鼠相比,经过4周游泳运动,心脏重量与胫骨长比值（HW/TL）显著降低,说明心脏重构被显著抑制;肺脏重量与胫骨长比值（LW/TL）显著下降,说明心衰改善明显;同时,经过4周游泳运动,心梗后小鼠+LVdP/dtmax显著升高（p<0.05）,左心室舒张末压力（LVEDP）显著下降（p<0.05）,说明4周游泳运动能显著改善心梗后小鼠心脏功能,超声心动图也进一步证实了这一结果。（2）小鼠心梗后进行4周游泳运动使得心肌间质纤维化程度降低了 30.0%（p2.0和p<0.05作为标准,对得到的具有变化趋势的miRNAs进行筛选,得到10种差异表达的miRNAs。进一步采用RT-qPCR对10种表达差异的miRNAs进行验证,最终确定了 5种运动后上调的miRNAs。使用乳鼠心肌细胞建立缺氧模型在体外水平评估了所有5种上调的miRNAs的作用,发现只有miR-1192的模拟物对缺氧的心肌细胞的存活有显著影响,存活率升高约60%（p<0.05）,进一步检测发现,miR-1192对细胞存活率的影响可能是通过抑制缺氧心肌细胞的凋亡实现的。（4）采用心肌内点注射miR-1192的Agomir,来模拟miRNA-1192的升高。结果显示,心肌内点注射Agomir之后,其水平显著升高（p<0.01）。心肌内点注射Agomir并建立心肌梗死损伤4周之后,发现经过Agomir的治疗,心肌梗死小鼠+LVdP/dtmax显著升高了 31.97%（p<0.05）,LVEDP 显著降低 22.91%（p<0.05）,进一步超声心动图的结果也证实心梗后上调miR-1192的水平能够显著改善小鼠心脏功能;与心梗组相比,给予Agomir使得心肌组织间质纤维化降低了 40.2%（p<0.05）,心肌细胞凋亡的比例降低了 42.2%;Bax和TGF-β1的表达显著降低,切割的Caspase 3分子的表达量显著减少,Bcl-2表达量显著增加,说明心肌梗死之后给予Agomir减弱了心肌梗死导致的心肌细胞间质纤维化和心肌细胞凋亡。（5）利用miRNA-1192的抑制物Antagomir进行体内抑制内源性miR-1192的水平。通过qPCR对其水平进行检测,结果显示,心肌内点注射Antagomir之后,miR-1192的水平显著降低（p<0.01）。同时,血流动力学指标下降、Bax、TGF-β1和切割的Caspase 3分子的表达量上调,而Bcl-2表达量显著下调。说明Antagomir在一定程度上抵消了运动带来的心脏保护作用。（6）为了寻找miR-1192的靶分子,我们首先对其进行了预测,对得到的靶基因采用DAVID基因功能分类,并在细胞水平进行验证,结果显示miR-1192模拟物mimic显著降低了 Caspase 3蛋白表达水平（p<0.05）,而Caspase 9和CREB1的蛋白表达水平没有差异。使用荧光素酶报告基因检测法进一步检测了 Caspase3 3’非翻译区（3’UTR）中miR-1192的结合位点,同时用缺氧心肌细胞模拟心肌梗死,发现给予miR-1192的模拟物能够显著改变Caspase 3的表达水平。研究结论:（1）本研究证实有氧运动可以上调SIRT3/SOD2表达,进而改善自发性高血压大鼠心脏的氧化还原状态。长期中等强度运动引起的抗氧化防御能力的增强改善了线粒体功能,维持心脏线粒体的正常氧化还原状态。（2）本研究证实有氧运动增加了 miR-1192的循环水平,miR-1192通过下调Caspase 3的表达介导了运动对心肌梗死的保护作用。抑制miR-1192的表达,抑制了有氧运动对心肌梗死后心脏的保护作用。这些发现表明,miR-1192是一种在运动诱导的心脏保护中的新型运动因子,有望用于治疗心肌梗死。