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第一部分：BDNF对骨髓基质细胞表达RANKL的影响和机制研究目的体外实验探讨MM细胞分泌的BDNF对骨髓间充质干细胞分泌RANKL的影响和相关信号通路方法分离培养正常人的原代骨髓间充质干细胞并进行鉴定；在体外应用人重组BDNF刺激人骨髓间充质干细胞,RT-PCR或Western Blot法检测BDNF对骨髓间充质干细胞分泌RANKL的影响；加入BDNF高亲和力受体TrkB的拮抗剂K252a,ELISA法检测K252a对骨髓间充质干细胞分泌RANKL的影响；Western Blot法检测骨髓间充质干细胞内ERK、AKT和I-kB的磷酸化水平,免疫荧光法检测NF-kB p65亚基的核转位情况；利用0.4μm Transwell构建MM-BMSCs两系共培养和MM-BMSCs-preOC三系共培养体系,并以K252a进行干预,检测MM细胞分泌的BDNF对两系和三系共培养体系中破骨细胞形成的影响。结果人间充质干细胞表达CD44、CD105和CD29,不表达CD14, CD45,通过成骨细胞诱导液诱导能向成骨细胞定向分化；人重组BDNF能在mRNA水平和蛋白水平促进骨髓间充质干细胞内RANKL的表达,这种作用具有时间和剂量依赖性,而且能被K252a部分拮抗；25ng/mlBDNF刺激人间充质干细胞5min后,能检测到磷酸化ERK水平的升高,15min达到峰值；同浓度BDNF作用于人骨髓间充质干细胞5min后磷酸化的AKT水平显著增加；BDNF对人间充质干细胞内I-kB水平和p65亚基的核转位没有明显影响；ERK抑制剂U0126能显著阻断BDNF对人骨髓间充质干细胞分泌RANKL的促进作用,AKT抑制剂LY204002对RANKL的分泌也存在抑制,但是这种作用不具有统计学意义(P=0.069),提示MEK/ERK是BDNF促进人骨髓间充质干细胞分泌RANKL的主要调控通路。人间充质干细胞与MM细胞系和原代MM细胞共培养能促进RANKLmRNA的表达,K252a能部分抑制这种促进作用；当preOC与多种MM细胞共培养或者preOC与MM细胞、人间充质干细胞三系共培养时,破骨细胞的数目均有显著增加；BDNF的中和性抗体能部分抑制这种上调作用,OPG则能完全拮抗该作用。结论人重组BDNF能促进骨髓间充质干细胞内RANKL的表达；这种作用可能是通过MEK/ERK信号通路实现的；在两系和三系共培养体系中,MM细胞通过分泌BDNF能促进骨髓间充质干细胞内RANKL的表达和破骨细胞形成。第二部分：基因沉默骨髓瘤细胞BDNF的表达抑制小鼠骨髓瘤模型的骨质破坏和肿瘤生长目的通过慢病毒shRNA载体下调BDNF在骨髓瘤细胞系ARH77和RPMI8226的表达,建立SCID-rab-ARH77和SCID-RPMI8226小鼠人骨髓瘤模型,在体内实验中研究基因沉默BDNF对骨髓瘤骨质破坏和肿瘤负荷的影响及可能机制。方法构建能反向抑制BDNF的shRNA序列,利用慢病毒载体将其转染至骨髓瘤ARH77和RPMI8226细胞,流式细胞分选术筛选出eGFP阳性、稳定转染BDNFshRNA的细胞群,使用Western Blot法验证该shRNA载体对BDNF的基因沉默作用；构建SCID-rab-ARH77模型时,将新鲜兔骨移植至NOD/SCID小鼠皮下,待移植骨存活后,将稳定转染BDNFshRNA的ARH77细胞(AS组)注射至小鼠皮下兔骨的骨髓腔；构建SCID-RPMI8226模型时,将稳定转染了BDNFshRNA的RPMI8226细胞(AS组)直接通过尾静脉注射入SCID小鼠体内,并以非特异性序列转染的细胞作为空载体组(EV组)；小动物荧光活体成像实验连续监测骨髓瘤细胞的体内生长情况,观察总体存活时间,按Kaplan-Meier法绘制生存曲线,用Log-rank检验比较生存率；X线和骨密度检测观察荷瘤小鼠的骨质损害情况；H&E染色观察肿瘤浸润和骨质破坏情况；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测骨髓切片破骨细胞的密度；免疫组化、Western Blot和ELISA方法检测动物模型体内中BDNF和RANKL的含量；结果SCID-rab-ARH77模型小鼠的骨骼x线拍摄显示,低表达内源性BDNF的AS组小鼠,其皮下兔骨的溶骨性损害程度明显低于EV组(每组12只,P=0.02)；H&E染色显示AS组骨片具有相对正常的骨结构和连续的骨皮质,而EV组的兔骨正常结构被破坏、骨小梁被吸收、肿瘤突破骨皮质；相对于接种删细胞前,EV组的BMD降低68%±5%,而AS组BMD仅下降15%±8%(P<0.05)；TRAP染色显示AS组骨片的破骨细胞密度显著低于EV组(P<0.01)；接种了AS-ARH细胞的兔骨,其髓浆内BDNF和RANKL浓度明显低于EV组(P<0.01)；在肿瘤负荷方面,AS组小鼠外周血循环中的人IgG含量明显低于EV组(n=12,P<0.05),总体生存期较EV组显著延长(P<0.05)。类似地,在SCID小鼠经尾静脉注射MM细胞的骨髓瘤模型,我们发现,与EV组相比,低表达内源性BDNF的AS组小鼠其骨质破坏程度低、肿瘤负荷和血管新生水平低、生存期延长。结论稳定沉默MM细胞中BDNF的表达,能降低骨髓微环境中RANKL的水平,从而抑制破骨细胞活化过度导致的骨质破坏,降低肿瘤负荷。骨髓瘤分泌的BDNF在体内骨髓瘤的生长及骨质破坏过程中起重要作用,可能成为多发性骨髓瘤治疗。