脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤之一,恶性水平高,具有很高的发病率与死亡率。近年来,虽然人们在脑胶质瘤的手术医治以及术后放疗、化疗等方面取得了长足的进步,但是恶性脑胶质瘤病人的预后依然很差,确诊后的平均生存周期不超过15个月。最新的研究发现,脑胶质瘤细胞中存在一小部分具备干细胞特征的细胞亚群,这类细胞可以持续增殖,具备自我更新能力和多向分化潜能,被定义为脑胶质瘤干细胞(Glioma stem cells, GSCs)。GSCs细胞的存在是脑胶质瘤形成、浸润、转移、复发以及放化疗耐受的主要原因。MicroRNAs (miRNAs)是一类在进化上高度保守,长度大约在22nt左右的非编码RNA分子,可以通过直接作用于下游mRNAs的3端非翻译区(3’Untranslated Regions,3’UTR)阻止mRNAs的转录,和域诱导mRNAs的降解,进而在转录后水平调控机体内基因的表达。越来越多的证据表明,miRNAs分子能够起着类似于原癌基因或者抑癌基因的作用,影响肿瘤细胞的形成与发展。此外,也有文献报道指出miRNAs在肿瘤干细胞分化和自我更新的调控中也发挥着重要的功能。因此,可以通过改变miRNAs的表达量来降低肿瘤细胞和肿瘤干细胞的恶性程度,这可能是一个很有前景的治疗方案。在本研究中,作者通过高通量测序技术筛查发现,与脑胶质瘤细胞相比,GSCs细胞中miR-92a的表达水平显著降低。之前的文献报道表明,miR-92a在脑胶质瘤细胞系和脑胶质瘤病人的组织标本中高表达,降低miR-92a的表达水平可以抑制脑胶质瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡。然而,miR-92a在脑胶质瘤细胞迁移、侵袭以及GSCs细胞生存、迁移和自我更新中的功能尚不明确。所以,充分了解miR-92a在这两种细胞中的功能和具体分子机制,可以为脑胶质瘤的治疗提供新的思路。研究目的探索miR-92a在脑胶质瘤以及GSCs细胞中的功能和详细作用机制,为脑胶质瘤的靶向治疗提供新的理论依据。实验方法1.采用无血清饥饿培养法从脑胶质瘤细胞(U87和U251)中分离培养出GSCs细胞,并用免疫荧光染色法鉴定GSCs细胞;2.采用第二代高通量测序技术比较U87细胞和来源于U87的GSCs细胞U87s中miRNAs的表达量差异;3.采用MTT、细胞划痕、Transwell以及Annexin V-FITC/PI双染法检测miR-92a对U87和U251细胞体外增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响;4.采用裸鼠成瘤实验检测miR-92a在体内对脑胶质瘤细胞生长的影响;5.采用qPCR、Western Blot和肿瘤干细胞球成球等实验检测miR-92a对GSCs细胞生长、迁移以及自我更新的影响;6.结合生物信息学方法和双荧光素酶报告系统预测并鉴定miR-92a在脑胶质瘤细胞和GSCs细胞中的靶基因;7.采用Western Blot和免疫荧光染色法确定miR-92a在脑胶质瘤细胞和GSCs细胞中作用的分子机制。实验结果1.利用无血清饥饿培养法从脑胶质瘤细胞(U87和U251)中分离出GSCs细胞(U87s和U251s),免疫荧光染色实验结果表明,GSCs细胞表面表达肿瘤干细胞的分子标志CD133和神经干细胞的分子标志Nestin,分化后的GSCs细胞表达神经胶质细胞的分子标志GFAP以及神经元细胞的分子标志β-tubulin Ⅲ;2.高通量测序的分析结果显示共有94个miRNAs在U87细胞和U87s细胞间差异表达,其中miR-92a在U87s细胞中显著低表达。qPCR鉴定结果表明miR-92a在U87s细胞和U251s细胞中均显著下调;3.下调miR-92a的表达量在体外可以有效的降低U87细胞和U251细胞的增殖和转移能力,同时促进细胞凋亡;4.降低miR-92a的表达水平可以有效的抑制脑胶质瘤裸鼠模型体内肿瘤的生长;5.在GSCs细胞中上调miR-92a的表达量后,肿瘤干细胞球直径变小、细胞迁移能力减弱、肿瘤干细胞球形成率降低,细胞干性维持相关分子标志表达量下调;6.生物信息学预测和双荧光素酶报告系统结果表明miR-92a在脑胶质瘤细胞和GSCs细胞中可作用于不同的靶基因,miR-92a在脑胶质瘤细胞中的靶基因为CDH1,在GSCs细胞中的靶基因则为Notch-1;7.脑胶质瘤细胞内miR-92a的表达量下调后,CDH1蛋白量增多,细胞核内p-catenin含量减少,而总的p-catenin含量不变;8.在GSCs细胞内过表达miR-92a后,Notch-M蛋白下调,细胞内磷酸化Akt的含量减少,而总的Akt含量不变;9.过表达CDH1可以抑制脑胶质瘤细胞的转移能力,而降低Notch-1的表达则可抑制GSCs细胞的生长、迁移和自我更新能力。结论本研究首先从脑胶质瘤细胞中分离出GSCs细胞,通过高通量测序技术发现miR-92a在两种类型的细胞中差异表达。qPCR结果证实,与脑胶质瘤细胞相比,GSCs细胞内miR-92a的含量明显降低。降低miR-92a的表达水平可有效抑制脑胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,并促进细胞凋亡;miR-92a含量减少后,脑胶质瘤裸鼠模型体内肿瘤生长速度也明显减慢。另一方面,上调miR-92a的含量可以显著抑制GSCs细胞的生长,迁移和自我更新。深入的机制研究表明,miR-92a可以通过分别作用于下游CDHl/p-catenin和Notch-1/Akt信号通路,影响脑胶质瘤细胞和GSCs细胞的恶性表型。上述实验结果表明miR-92a在脑胶质瘤的形成和发展过程中起重要作用。