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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是结核病的致病菌,且是最成功的胞内致病菌之一。随着耐多药和广泛耐药结核分枝杆菌(Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis,MDR-TB,Extensive-resistant Mycobacterium tuberculosis,XDR-TB)的出现和蔓延,结核病的治疗面临着巨大挑战,结核分枝杆菌耐药机理的研究尤为迫切。外排能力的增强、抗生素靶标的保护及突变、药物的降解和细胞壁通透性降低等参与结核分枝杆菌耐药。其中,通过外排药物降低胞内药物含量的方式主要是由外排泵介导。根据外排泵的结构、转运底物及能量来源的不同,可将外排泵分为五个家族:主要易化子超家族(major facilitator superfamily,MFS)、ATP结合盒家族(ATP binding cassette,ABC)、耐受小节分裂区家族(resistance nodulation cell division,RND)、多药及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)和小多重耐药性家族(small multidrug resistance family,SMR)。其中,MFS家族属于二级转运蛋白家族,包含了74个成员,是一种古老而普遍存在的转运蛋白家族,能够依靠质子动力势来驱动底物的运输。此外,MFS家族蛋白的转运底物很广,包括离子、糖类、氨基酸、多肽、药物以及其他的小分子等。本研究以结核分枝杆菌MFS转运体蛋白Rv1634为研究对象,探究其在药物耐受中的作用。对Rv1634进行生物信息学分析,发现其具有典型的MFS家族蛋白的结构特点。为了进一步地研究Rv1634的功能,我们利用分子克隆技术,以耻垢分枝杆菌为模式菌株,成功地构建了过表达菌株Ms_Rv1634和对照菌株Ms_pALACE。通过MIC的测定、抗生素胁迫以及胞内溴化乙锭积累等实验,发现Rv1634的过表达能够显著地增强耻垢分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的耐受,并降低胞内溴化乙锭的积累。此外,用外排泵抑制剂—羰酰氰间氯苯腙、利血平和维拉帕米的处理,发现Ms_Rv1634在羰酰氰间氯苯腙的处理下药物耐受能力减弱,胞内溴化乙锭(EtBr)的积累量也出现了一定程度的回升。以上结果表明Rv1634编码一个功能性的外排泵,与预测结果一致。为了探讨Rv1634介导的药物耐受机制,我们开展了qRT-PCR及启动子活性检测等实验,发现在诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星等抗生素的胁迫下,Rv1634在耻垢分枝杆菌中的同源基因MSMEG3815的转录水平显著上调,且启动子活性也有所提升。此外,我们测定了Ms_Rv1634和Ms_pALACE在抗生素压力下胞内活性氧含量及膜电位的变化,发现Ms_Rv1634胞内活性氧含量明显低于Ms_pALACE,且能够维持膜电位稳定;过氧化氢胁迫实验证明Rv1634的过表达并不影响耻垢分枝杆菌对过氧化氢的敏感性,该结果佐证了Rv1634不能以外排羟基自由基等物质的方式介导细菌对氟喹诺酮类药物的耐受;生物膜实验结果显示Rv1634的过表达能够导致生物膜褶皱的增多。综上所述,我们推测Rv1634可能通过药物外排和减弱细菌胞壁通透性的方式,降低细菌胞内抗生素含量,减少活性氧的产生,进而维持细菌的稳态,增强细菌对氟喹诺酮类药物的耐受性。本论文揭示了结核分枝杆菌MFS转运蛋白Rv1634参与氟喹诺酮类抗生素耐受的潜在机制,并可为结核病的治疗提供新的方法和思路。