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本篇论文的主要工作是人类神经tau蛋白与DNA的相互作用,初步探讨了tau蛋白对体外DNA复制、转录的影响,进而检测了细胞过表达tau蛋白后对细胞周期分布的影响。另外一部分内容是SARS病毒NP9b基因的克隆、表达、纯化等方面的研究。
Tau属微管结合蛋白的成员,广泛存在于神经元轴突,与微管组装和稳定有关。该蛋白质的异常聚集所形成神经纤维缠结(NFT)与多种神经退行性疾病(tauopathies)相关。因此神经tau的结构和功能成为当前研究的热点。最近的研究表明,tau蛋白不仅存在于神经元的轴突,同时也存在于神经瘤细胞以及某些非神经细胞的核内,并与染色体和核仁区结合。然而tau蛋白存在于细胞核内的原因尚不清,该蛋白在核内可能具有与DNA相互作用的功能。
通过PCR法检测了tau对DNA扩增的影响,结果表明tau蛋白的加入可抑制DNA扩增。实时定量PCR显示,tau蛋白对DNA扩增半抑制量的摩尔比tau23:~2/1([蛋白]/[DNA]);tau40:~4/1([蛋白]/[DNA])。引物延伸法(37℃)显示,当[tau]/[DNA]为1/10时,DNA的复制过程被显著抑制,仅为对照的12%~15%。这种对DNA扩增的抑制现象与Histone相类似,而对照蛋白BSA无相应作用。竞争双链DNA的加入可以解除tau蛋白对DNA复制的抑制作用,暗示tau对DNA复制的抑制可能由于结合了DNA模板,而不是抑制了DNA聚合酶活性。体外实验表明,tau的存在不影响T7RNA聚合酶启动的转录反应。该结果提示:在转录过程中RNA聚合酶沿模板移动时可将结合的tau蛋白从模板上置换下来。另外,通过毛细管电泳法检测tau与单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)的相互作用,结果显示tau与ssDNA和dsDNA都有结合,但与ssDNA的结合早于dsDNA,说明tau与ssDNA的亲和力稍强于dsDNA。
为了检测tau在细胞内过表达是否对细胞周期有影响,本文作者分别采用tau352(3R0N)和tau383(4R0N)的真核质粒pEGFP瞬时转染(内源性tau表达很低)人胚肾293细胞。结果表明,外源性tau蛋白表达后主要分布于细胞质中,而细胞核内分布相对较少。细胞转染3天后,表达荧光蛋白的阳性细胞百分率分别为32.81%(GFP),35.58%(tau-3R)和38.76%(tau-4R)。与空载体pEGFP转染的细胞和未转染细胞比较,转染tau3R或tau4R质粒的细胞其G1期细胞分布减少4%,而S期稍增多3.5-4.5%,G2-M期无明显变化。表明外源性tau改变了细胞周期的分布,使细胞阻滞于在S期,但具体机制尚不明确。
另外,从SARS冠状病毒基因组(BJ01)中,克隆了NP9b(NP_82885(9-).1)基因(ORF9b,28115-28411,297bp),编码分子量约11KD的未知功能病毒特异性蛋白。构建了pET32c-NP9b的原核表达载体,转化E.coli并表达纯化了11KD的目的蛋白。ELISA显示该蛋白与SARS病人血清呈阳性反应,表明此蛋白可能在病毒感染过程中存在于病人的体内,并诱导产生了相应的抗体。采用圆二色光谱和红外光谱分析了该蛋白的二级结构。然而该蛋白的生物学功能还有待于进一步的确定。