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木质纤维素是地球上丰富的可再生资源,充分高效资源化利用这些资源对于治理环境污染、发展生物能源以及维持农业可持续发展意义重大。木质纤维素的微生物分解与转化是其资源化利用的有效途径之一,获得高效分解木质纤维素的微生物是生物分解与转化利用的前提。在自然条件下,木质纤维素的分解是在众多微生物的协同作用下完成的,复合微生物群体功能研究是该领域的研究热点之一。本实验室获得了稳定高效分解木质纤维素的复合菌系WSC-9,具有强大的木质纤维素分解能力。本研究利用微生物分离技术对复合菌系WSC-9进行纯培养菌株的分离和鉴定,明确菌系的微生物组成,并通过人工组合获得组分简单且可高效稳定降解纤维素的复合菌系,进一步利用菌株敲除手段,分析复合菌系内菌株的功能及其协同作用关系,初步分析复合菌系分解木质纤维素的机理。(1)通过微生物分离技术,获得8株细菌纯培养菌株,其中5株好氧(WSC-9-1、WSC-9-2、WSC-9-3、WSC-9-4、WSC-9-5),3株厌氧(WSC-9-A、WSC-9-B、WSC-9-C)。好氧细菌通过稀释平板法获得,厌氧菌株则是将Hungate厌氧操作技术改进而获得。对这些菌株的16S rDNA基因序列进行比对发现,它们分布在5个属(Ureibacillus、Brevibacillus、Clostridium、Pseudomonas和Bacillus)中。通过T/A克隆,明确复合菌系WSC-9共包括10株细菌,均分布在上述5个属中。(2)对纯培养菌株的纤维素降解能力进行测试时发现,5株好氧细菌均无纤维素降解能力。3株厌氧细菌中的WSC-9-B可稳定高效降解纤维素,菌株WSC-9-A次之,WSC-9-C不能降解纤维素。WSC-9-B在50℃下静止培养10 d,可降解稻秆总干重的53.8%,其中降解纤维素64.3%,半纤维素44.7%,木质素16.8%(复合菌系可降解稻秆总干重的80.9%,其中降解纤维素92.1%,半纤维素73.8%,木质素50.9%)。但是,该菌株在培养过程中不具备恢复培养液pH的能力,使pH一直下降至5.5左右并维持不变。对该菌株的生理生化性质检测发现,其最适生长温度为50℃,最适pH为7.0,能够利用葡萄糖、果糖、核糖、甘露糖、甘露醇、蜜二糖、蔗糖、木糖、纤维二糖、纤维素、滤纸、稻秆、乳糖、木聚糖、麦芽糖等碳源,代谢产物主要有乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、己酸等。形态学观察发现,该菌株为杆菌,0.40-0.55μm×2.00-3.00μm,产孢,圆形,端生。16S rDNA序列比对,该菌株与克隆结果HAW-RM37-2-B-1600d-W(FN563295)的相似性均达到99%,因此从系统发育学上判断WSC-9-B属于Clostridium属。(3)通过组合2株好氧细菌(WSC-9-3、WSC-9-5)和3株厌氧细菌(WSC-9-A、WSC-9-B、WSC-9-C)重新构建了一个新的具有纤维素分解能力的组合,此组合在培养10 d时,可降解培养体系中84.3%的滤纸。厌氧细菌WSC-9-A和WSC-9-B可以降解纤维素,是复合系中的关键菌株。无纤维素降解能力的好氧细菌WSC-9-3和WSC-9-5主要是一些挥发酸生成菌群和基质分解菌群,调节培养体系中的环境,为纤维素分解菌创造适宜的分解环境。厌氧细菌WSC-9-C可以调节培养液的pH,以保证分解体系维持在一个稳定的pH范围内。