文心兰(Oncidium hybridum)为兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendroideae)文心兰属的植物,其花序分支性良好,花形优美,盛开时宛若飞舞的女郎,因此又有跳舞兰之称。文心兰作为我国台湾地区第一大外销切花花卉,主要以文心兰’南茜’(nc.Gower Ramsey)和’柠檬绿’(Onc.Honey Angel)为主,颜色均为单一黄色。然而欧洲国家对黄色系花卉的接受程度不高,在这些国家黄色系花卉代表分离和哀伤,因此若要拓展文心兰的外销市场,需有不同花色品种的育成,来提高市场对文心兰切花的接受程度。但’南茜’和’柠檬绿’具有自交和杂交不亲和性,在自然条件下无法进行天然授粉而获得果荚,并且经多方努力进行杂交试验,仍无法育出新品种。目前,相关研究人员已对’南茜’杂交不亲和性问题进行了初步探讨,发现其花粉败育是导致杂交授粉困难的主要原因。因此,本研究打算从细胞形态学和分子生物学两个方面对’柠檬绿’花粉败育问题进行初步探讨,藉此找出其花粉败育的原因,为文心兰杂交育种的研究提供理论基础。主要研究结果如下:1文心兰花粉的细胞形态学观察通过对文心兰不育品种’柠檬绿’、’南茜’和可育品种’巧克力’的花粉团形态进行观察,发现’柠檬绿’和’南茜’的花粉团药室明显变扁,外壁凹陷、皱缩,组成花粉团的花粉粒排列非常紧密,形状不规则,并且’柠檬绿’成熟的花粉团中无明显的花粉粒附着现象。花粉粒的扫描电镜观察结果显示:与可育品种’巧克力’相比,不育品种’柠檬绿’的花粉粒大小和形状不规则,花粉壁发育不连续,有很多孔洞(并非萌发孔)。显微观察发现,’柠檬绿’花粉细胞大小和形状不规则,细胞质高度液泡化。花粉母细胞的DAPI染色结果显示,’柠檬绿’花粉母细胞在减Ⅰ末期及减Ⅱ末期形成的子细胞中的遗传物质未实现均等分配,从而产生的四分体小孢子中含有数目不等的染色体。在减Ⅱ末期,甚至会形成三分体小孢子或多分体小孢子。综上所述,’柠檬绿’花粉败育可能与以下问题有关:1.花粉壁发育异常。此问题会造成花粉细胞内含物外流,而内含物的外流将无法为小孢子的正常发育提供必需的营养物质,进而影响小孢子的正常发育。2.花粉母细胞的减数分裂过程异常。’柠檬绿’花粉母细胞在减数分裂过程中可能出现同源染色体的配对、联会和重组等环节异常,从而导致小孢子中含有数量不等的染色体,影响其正常发育。2文心兰与堇花兰花粉转录组测序比较分析以文心兰和堇花兰花粉为材料,采用第二代高通量Illumia HiSeqTM4000测序平台进行转录组测序分析,利用生物信息学分析二者之间的差异表达基因,并利用qRT-PCR验证转录组测序结果。本研究共获得132,789条Unigenes,按照差异倍数不低于4(|log2Ratio|≥4)且错误发现率不高于0.001(FDR≤0.001)为条件筛选出48,066条DEGs,其中上调表达的基因16,527条,下调表达的基因31,539条。与花粉发育相关的差异表达基因的数目是1200个,其中上调基因数量475个,下调表达基因数量725个,涉及花粉发育、花粉萌发、花粉管生长、花粉壁形成、减数分裂等相关基因。从上述1200个差异基因中挑选了 145个进行层次聚类分析,筛选出31条具有显著性差异表达的基因,上调表达的基因7条,下调表达的基因24条。为了验证RNA-Seq测序数据的可靠性,本研究从31条显著差异表达基因中选取了 9条基因进行qRT-PCR分析,结果表明这9个差异表达基因qRT-PCR试验结果与测序数据一致性很好,表明转录组测序结果可信度高。结合上述分析结果,以差异表达基因的功能注释为依据,从上述9条差异表达基因中选取了 5条基因进行进一步的定量分析,结果表明这5条差异基因在可育植株堇花兰和’巧克力’中的表达量均显著高于’柠檬绿’,差异倍数均大于3,证明筛选出的基因确实为’柠檬绿’和堇花兰花粉发育过程中显著差异表达的基因。3文心兰OnMAD2基因的克隆、生物信息学及定量表达分析参考文心兰’柠檬绿’花粉团转录组数据库中OnMAD2基因的已知序列,本试验对文心兰OnMAD2的CDS区进行了验证和一系列分析。RT-PCR结果显示:OnMAD2的基因编码区624bp,编码207个氨基酸;gDNA长度为961bp,含有2个内含子和3个外显子。生物信息学分析发现:文心兰OnMAD2属于HORMA超家族,具有HORMA结构域,文心兰OnMAD2与石斛兰MAD2(PKU87023.1)的亲缘关系最近,其次是深圳拟兰(PKA55503.1)。OnMAD2的蛋白序列与其他物种的MAD2蛋白序列具有较高的相似性,均在70%以上,说明MAD2蛋白在植物中具有很强的保守性。不同组织器官的qRT-PCR结果显示:文心兰OnMAD2在根中具有极高的表达水平,在假鳞茎中的相对表达量最低,具有明显的组织特异性,推测该基因可能在根中能够正常表达。不同花期的qRT-PCR结果显示:文心兰OnMAD2在半开放期的相对表达量最高,其次是盛开前期,在盛开期的相对表达量最低。推测该基因可能在花粉母细胞减数分裂过程中起控制染色体分离的作用。4文心兰OnMYB106基因的克隆、生物信息学及定量表达分析参考文心兰’柠檬绿’转录组数据库中OnMYB106基因的已知序列,本试验对文心兰OnMYB106的CDS区进行了验证。RT-PCR结果显示:OnMYB106的基因编码区819bp,编码272个氨基酸;gDNA长度为1005bp,含有2个内含子和3个外显子。生物信息学分析发现:OnMYB106属于SANT超家族,具有2个连续的MYB结构域,是一个典型的R2R3-MYB。OnMYB106与水稻的OsMYB106(OC_Os08g33660.1)的进化距离最近,推测这两个基因可能具有相似的功能,都属于调控花粉发育的一类转录因子。不同组织器官的qRT-PCR结果显示:文心兰OnMYB106在花器官中具有较高的表达水平,在其它组织部位虽有表达,但表达量都很低,推测该基因可能在花器官的生长发育过程中发挥重要作用。不同花期的qRT-PCR结果显示:文心兰OnMYB106在花苞期的表达量最高,盛开期时只有微量表达,推测该基因属于花粉发育“早期”表达的基因,主要调控花粉壁的合成。5文心兰OnMAD2和OnMYB106基因过表达载体的构建及瞬时转化本试验利用传统的酶切连接法将OnMAD2和OnMYB106目的基因与植物表达载体pCAM-BIA1301相连接,成功构建了两个过表达载体p1301-MAD2-GUS和p1301-MYB106-GUS。利用农杆菌介导法将过表达载体转入文心兰PLBs中进行瞬时转化,RT-PCR检测结果显示:阳性对照和转基因PLBs中均有GUS和潮霉素基因。qRT-PCR与RT-PCR的检测结果相一致,GUS基因仅在阳性对照和转基因PLBs中有表达。目的基因的qRT-PCR结果显示:相对于阳性对照和阴性对照,文心兰OnMAD2与OnMYB106在转基因PLBs中均呈现极显著升高,综合上述结果说明p1301-MAD2-GUS和p1301-MYB106-GUS两个过表达载体瞬时转化成功。