目的:放射治疗是广泛应用于脑肿瘤和头颈部恶性肿瘤的一种重要的治疗手段,随着精准放疗技术日益进步,患者的生存期显著延长。由于解剖结构特殊,正常脑组织结构不可避免地受到照射,导致患者在治疗后长期生存过程中出现不可逆转的认知功能障碍,严重影响患者的生存质量。电离辐射导致的神经发生受抑制是放射性认知功能障碍的主要发生机制之一,神经发生是指神经干/前体细胞分化为神经元,新生神经元存活、迁移、成熟并最终整合到现有神经网络中发挥神经功能的过程。自噬是一种依靠溶酶体降解细胞器和蛋白质进行循环利用的过程,其主要功能是选择性地降解不必要的、潜在有害的胞浆物质。研究显示自噬缺陷可导致神经发生受抑制,然而自噬在放射性认知功能障碍中的作用尚不明确。本课题组的前期研究发现,米诺环素可通过抑制大鼠海马区新生神经元凋亡减轻大鼠的放射性认知功能损害,米诺环素的这种作用可能与其诱导自噬保护辐射损伤的神经元有关。为了进一步研究自噬在电离辐射所致神经发生受抑制中的作用,本研究以体外培养的小鼠胚胎神经干细胞为研究对象,首先研究神经干细胞在电离辐射作用后自噬水平的变化,随后深入探究自噬在电离辐射所致神经干细胞辐射损伤中的作用及机制,以探讨将自噬作为防治放射性认知功能障碍的潜在靶点的可能性。研究方法:本研究第一部分首先以酸性自噬囊泡生成率和自噬相关蛋白表达水平为指标检测神经干细胞受照后自噬激活情况,并通过检测凋亡率验证自噬对辐射损伤的神经干细胞的保护作用。通过流式细胞术检测在0-2 Gy X射线照射后吖啶橙染色的神经干细胞中酸性自噬囊泡生成率的变化,并通过蛋白免疫印迹技术检测电离辐射作用后神经干细胞中自噬相关蛋白如P62、Atg4B、Atg7、LC3-II以及p-mTOR的表达水平,以全面评估神经干细胞在不同剂量X射线照射后自噬水平的变化。随后通过感染慢病毒干扰自噬关键基因Atg7的表达以达到下调神经干细胞自噬水平的目的,并通过蛋白免疫印迹和流式细胞术等方法验证。为了研究自噬在辐射损伤的神经干细胞中是否存在保护作用,采用流式细胞术检测Atg7敲低的神经干细胞在不同剂量X射线照射后凋亡率的变化,明确自噬在电离辐射所致神经干细胞凋亡中的作用。本研究第二部分继续探讨自噬对辐射损伤的神经干细胞的自我更新和分化能力的影响。首先对神经干细胞形成的神经球的直径和数目进行检测,分析Atg7敲低的神经干细胞在电离辐射作用后成球能力的改变并通过免疫荧光技术检测神经干细胞特异性标志物nestin的表达,成球能力以及nestin的表达水平反映了 Atg7敲低的神经干细胞受照后自我更新能力的改变。为了进一步探究凋亡在其中是否发挥作用,通过免疫荧光技术检测nestin和cleaved-caspase3双阳性的细胞,并在应用caspase3抑制剂z-VAD-FMK抑制凋亡后,检测Atg7敲低的神经干细胞受照后成球能力的改变。最后诱导神经干细胞分别向神经元和神经胶质方向分化,通过免疫荧光技术分别检测神经元以及神经胶质细胞特异性标志物的表达水平并测量神经元轴突长度,探究自噬下调对辐射损伤的神经干细胞分化能力的影响。结果:神经干细胞在0-2 Gy X射线照射后48 h,出现明显的自噬激活且呈剂量依赖性,其中1 Gy X照射后神经干细胞中酸性自噬囊泡生成率是未照射组的8.08倍,此外Atg7、LC3-II、P62、p-mTOR和Atg4B等自噬通路中的关键蛋白表达水平的变化均验证了神经干细胞受照后自噬水平增加。慢病毒感染神经干细胞敲低自噬关键基因Atg7的表达后,蛋白免疫印迹检测结果显示神经干细胞中Atg7蛋白表达水平显著降低。此外Atg7敲低的神经干细胞在1 Gy X射线照射后,酸性自噬囊泡生成率以及自噬关键蛋白LC3-II表达均低于NC对照组,这说明敲低Atg7有效抑制了神经干细胞受照后的自噬水平。流式细胞术检测Atg7敲低的神经干细胞在不同剂量X射线照射后凋亡的变化情况,结果显示Atg7敲低的神经干细胞在1 Gy X射线照后凋亡率显著增加,达到了 NC对照组的2.61倍。此外,0.1和0.2 Gy的X射线照射后,NC对照组神经干细胞凋亡率与未照射组相比无明显变化,但是Atg7敲低的神经干细胞受照后凋亡率显著增加,上述结果说明自噬能抑制电离辐射所致神经干细胞凋亡。随后本研究继续探究自噬对辐射损伤的神经干细胞的自我更新和分化能力的影响。Atg7敲低的神经干细胞在0-2 Gy X射线照射后成球能力呈剂量依赖性的显著降低,表现为神经球的数目减少,直径减小。此外,在0.1 Gy X射线照射后,Atg7敲低的神经干细胞nestin蛋白表达降低,说明自噬保护辐射损伤的神经干细胞的自我更新能力。Nestin和cleaved-caspase3双阳性的细胞在0.1 Gy X射线照射后阳性率显著增加,说明Atg7敲低的神经干细胞受照后干性下降与凋亡有关。凋亡抑制剂z-VAD-FMK预处理的Atg7敲低的神经干细胞,在0.1 Gy X射线照射后,形成神经球的直径和数目恢复到未受照神经干细胞的水平,说明自噬通过抑制凋亡保护电离辐射作用后神经干细胞的成球能力。免疫荧光技术检测神经元特异性标志物Tuj1,结果显示Atg7敲低的神经干细胞在0.1 Gy X射线照射后,分化形成的细胞Tuj1阳性率下降,且分化形成的神经元轴突在电离辐射作用后变短。神经胶质细胞的特异性标志物GFAP的检测结果同样显示,Atg7敲低的神经干受照后分化形成的细胞GFAP阳性率下降。上述结果说明自噬能保护辐射损伤的神经干细胞的多向分化能力。结论:本研究发现电离辐射诱导小鼠胚胎神经干细胞自噬激活,且呈剂量依赖性,激活的自噬可抑制电离辐射所致神经干细胞凋亡。下调自噬关键基因Atg7抑制神经干细胞中自噬水平后,辐射损伤的神经干细胞自我更新和分化能力下降,表明自噬在电离辐射所致神经发生抑制中发挥保护作用,且自噬的保护作用与其对凋亡的抑制有关,提示自噬可能成为防治放射性认知功能障碍的潜在靶点。