RNA螺旋酶可以通过水解三磷酸腺苷(ATP)供能来催化RNA双链解螺旋,在RNA代谢中发挥重要作用。DHX32是新发现的一种RNA螺旋酶,其广泛分布于体内组织,目前发现DHX32存在两种转录本,一种为DHX32全长,另一种通过可变剪切产生exon4缺失转录本(DHX32A4)。有研究表明,DHX32能改变Jurkat T细胞对Fas信号的敏感性,通过下调c-FLIP short的表达,从而促进JurkatT细胞凋亡。有研究表明,DHX32在结直肠癌中上调,且可以促进细胞生长及迁移,而最新的研究提示,DHX32通过β-catenin信号通路促进VEGFA的表达,从而促进肿瘤的生长。因此,DHX32可望作为结直肠癌新的生物标志物与治疗靶点。目前市场上仅有通过合成多肽免疫动物后得到的抗DHX32多抗,无商品化DHX32蛋白、抗DHX32单抗及检测试剂盒。因此,DHX32相关研究难以深入开展。研制DHX32蛋白及单克隆抗体可为DHX32的相关研究奠定基础。本研究通过原核表达系统,将DHX32全长蛋白、DHX32分段蛋白(1-250aa,251-403aa,404-743aa)进行表达和纯化;利用纯化的DHX32全长蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合及细胞筛选,得到30株DHX32单克隆抗体。通过与商品化DHX32多抗比较,自制DHX32单抗能够到达商品化多抗的检测能力,可用于替代商品化多抗,且自制抗体为单抗,具有较高的特异性。将DHX32单抗进行配对,最终筛选到两个配对包被5E6-标记12G9、包被8H7-标记12G9;在板式化学发光平台进行检测条件的优化,成功建立DHX32化学发光检测方法。该DHX32试剂盒的灵敏度为20pg/mL,检测上限>20ng/mL,且线性关系较好(R2>0.99),试剂盒的批内及批间稳定性较好。将自制DHX32抗体分别用于免疫组化实验和共聚焦显微镜细胞定位分析。运用蛋白质同源建模技术,对DHX32蛋白结构进行预测,发现DHX32的β-haripin结构域参与解螺旋,为研究DHX32的结构及功能提供参考。综上所述,本研究成功建立了 DHX32全长蛋白、DHX32片段蛋白的原核表达工艺,获得高纯度DHX32蛋白及三个片段;利用DHX32全长蛋白制备出多株DHX32特异性单抗,并筛选得到两对较好的抗体配对。建立了 DHX32板式化学发光检测方法,具有较宽的检测范围及良好的线性。为DHX32相关肿瘤的研究提供自主产权的重要原料,为相关研究奠定基础。