氧气的供给是一切细胞代谢存活和增殖分化的物质基础。在复杂的体内环境中,局部氧浓度的改变在各种病理疾病的发生发展进程中发挥了重要作用。以往研究发现,缺氧微环境促进新生血管生成,促进肿瘤细胞的转移能力,诱导炎性环境和酸性环境促进肿瘤细胞免疫逃逸和存活等过程,因此研究肿瘤缺氧微环境在肿瘤发生进程的作用机制已成为肿瘤治疗的研究热点。此外,大量研究证实肝脏损伤或炎症发生时伴有缺氧,并且缺氧程度随纤维化加重而加深。肝脏缺氧能够促进慢性炎症、ECM过度沉积和肝窦血管重构,肝脂肪酸氧化抑制等过程,从而加重肝纤维化进程。　　为适应局部缺氧的组织微环境,细胞通过调节相关基因的表达水平启动多种与缺氧耐受相关的生物学功能,从而保证机体适应缺氧。其中缺氧诱导因子(hypoxia inducerfactor-1,HIF-1)在该过程中发挥了核心作用。转录因子HIF-1激活近200个下游靶基因的上调表达,促进血管新生、细胞无氧糖酵解、胞外基质重构等生物学效应,保证机体内细胞适应含有不均衡氧浓度的体内微环境,但该过程所涉及的具体分子机制还未彻底阐明。在本研究中,集中探讨肿瘤组织和肝纤维化进程中普遍存在的缺氧微环境在促进肿瘤恶化进程及肝纤维化加重过程中发挥的生物学功能及具体的分子作用机制。　　CD147分子是一个高度糖基化的跨膜糖蛋白,通过促进肿瘤组织的基质重构,血管增生,代谢重编程,凋亡抵抗等多方面途径促进肿瘤恶化进程。近期的研究证实CD147分子可能参与机体纤维组织增生,但具体的分子机制尚不明确。　　作为特异性肿瘤生物标记物,CD147的高表达和肿瘤的不良预后呈显著相关,其生物学功能已被广泛阐述,但对于该分子的表达调控机制的研究还十分有限,特别是对于特定组织微环境中的CD147分子表达调控机制的研究几乎是空白。因此,本课题集中研究在肿瘤进展及肝纤维化进程中典型的缺氧微环境下CD147分子的表达调控机制及其相关的生物学功能,提出四点研究目标:确定CD147分子受缺氧微环境刺激后表达水平的变化;阐明缺氧诱导CD147分子上调的分子机制;明确CD147分子在促进肿瘤恶化中的具体生物学功能;探讨在肝纤维化过程中CD147分子的表达调控机制。　　第一部分:检测CD147分子表达水平与肿瘤组织缺氧程度的相关性。免疫组化结果显示在三种典型的上皮来源肿瘤组织中(肺癌,肝癌和乳腺癌),CD147分子的表达水平随着缺氧程度的加深而增强。进一步缺氧刺激三种相对应的上皮来源肿瘤细胞(A549,MCF-7 and HCC-9204),Western blot结果显示CD147分子蛋白表达水平与缺氧的时间和缺氧程度呈显著正相关,且该过程主要通过CD147分子转录水平的上调。　　第二部分:明确缺氧应激下转录因子HIF-1和Sp1协同转录上调CD147分子表达。通过上调或干涉HIF-1α蛋白在体外细胞中的表达水平,能够正向影响CD147分子的蛋白表达,提示HIF-1可能参与缺氧诱导的CD147上调表达过程。进一步通过构建不同长度的CD147核心启动子截短报告载体和含定点突变位点的报告载体,利用双荧光素酶报告系统证实转录因子HIF-1结合在CD147启动子区域的上游-133/-130,染色质免疫共沉淀进一步证实HIF-1能够靶向结合于CD147启动子核心区域。同时利用Sp1的特异性抑制剂光神霉素(MMA)证实转录因子Sp1对CD147启动子的基础转录活性具有重要作用。此外,利用不同P53表型的细胞系模型检测了P53分子可能参与缺氧应激CD147分子上调表达过程,但实验证实两者不相关。应用MCT-4分子缺陷的肝星状Lx-2细胞作为研究对象,进一步证实缺氧应激促进CD147分子表达上调的分子机制为Sp1协同HIF-1结合至CD147核心启动子区域,反正作用激活其转录,同时在MCT-4分子的协助下,过量表达的CD147分子在内质网中成功加工后转运至细胞膜,发挥相关的生物学功能。　　第三部分:阐明缺氧诱导CD147分子上调促进肿瘤恶化进程中的具体生物学功能。通过缺氧刺激A549细胞检测糖酵解相关参数证实缺氧能够促进肿瘤细胞发生代谢重编程,加速糖酵解代谢。干涉CD147分子的表达水平能够显著抑制肿瘤细胞葡萄糖摄取,乳酸分泌,乳酸脱氢酶活力等一系列糖酵解的表型参数,提示CD147分子参与促进糖酵解进程。进一步荷瘤裸鼠体内模型显示CD147的表达水平和裸鼠体内荷瘤组织18F-FDG摄取能力呈显著正相关,抑制CD147分子的表达水平显著降低MCT-1和MCT-4的表达,从而明确CD147分子与乳酸转运蛋白MCTs的相互作用为该分子促进肿瘤糖酵解的主要的作用机制。此外,抑制CD147分子的表达显著抑制了肿瘤的生长速率及肿瘤细胞的体外侵袭能力,促进体内外肿瘤细胞的凋亡,从而系统性地明确了CD147作为一个肿瘤相关分子在促进肿瘤恶化进程中的重要生物学功能。　　第四部分:探讨肝纤维化进程中CD147分子的主要表达调控机制及相关生物学功能。通过160例肝疾病病人组织切片的纤维化分期评估及CD147分子的表达水平分析,证实CD147分子的表达水平与肝纤维化进程中显著正相关。四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型进一步提示CD147分子随着肝纤维化加重表达上调,体内缺氧探针哌莫硝唑染色证实纤维化肝脏的缺氧微环境促进了CD147分子表达水平的上调。体外实验证实缺氧应激下各种肝细胞(HepG2,QZG,Lx-2)CD147的转录水平和蛋白表达水平都显著上调。此外,结合生物信息学分析手段及体外细胞实验提示肝纤维化进程高表达的CD147分子可能参与肝实质细胞外基质重构、肝窦内血管重塑及肝细胞脂肪酸代谢重编程这三个与肝纤维化进程紧密相关的生理过程,其具体分子机制需要进一步深入研究。　　根据上述结果,本研究明确了肿瘤组织及肝纤维化进程中的局部缺氧刺激能够上调CD147分子的表达水平,该过程主要通过转录因子HIF-1和Sp1结合至CD147核心启动子区协同反式激活CD147启动子的转录。进一步通过体外细胞系实验,荷瘤裸鼠体内实验及大量病人标本组织病理评估等方法系统性分析了组织缺氧微环境中上调表达的CD147分子的多种生物学功能,阐明了CD147分子在促进肿瘤糖酵解代谢中乳酸排泄,转移侵袭及抵抗肿瘤细胞凋亡的多种生物学功能,并且提示肝细胞膜及窦间隙上调表达的CD147分子可能参与了肝纤维化进程的多种生物学过程。