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研究目的:前期研究表明巨噬细胞表面的α7烟碱型乙酰胆碱受体(Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)是青藤碱(Sinomenine,SIN)发挥抗炎作用的关键靶点,而SIN的抗关节炎作用与α7nAChR的关系尚不明确。本研究首先考察SIN在大鼠佐剂性诱导关节炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)模型中是否可以作用于α7nAChR发挥抗关节炎作用,再进一步研究SIN对大鼠体内不同组织器官α7nAChR表达的影响,以及α7nAChR表达与AIA发病进程的关系,最后研究SIN对成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)的增殖及α7nAChR表达的影响。从以上方面探讨SIN通过α7nAChR发挥抗关节炎免疫药理机制。研究方法:1.SIN抗关节炎作用与α7nAChR的关系尾根部皮内注射完全弗氏佐剂建立大鼠AIA模型,分组为对照组、模型组、α-银环蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BTX)组、SIN 组、SIN+a-BTX 组、烟碱(Nicotine,Nic)组、Nic+a-BTX 组、吲哚美辛(Indomethacin,Indo)组、Indo+a-BTX 组、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组、MTX+a-BTX 组,给药周期为 30d,检测各组大鼠 0、6、12、18、24、30d足趾肿胀度、血沉、关节炎评分、血清中TNF-a含量,通过分析a7nAChR特异性拮抗剂是否能抑制SIN的作用来判断SIN抗关节炎是否与靶向a7nAChR有关。2.SIN对大鼠AIA模型α7nAChR表达的影响大鼠造模后第30d,对照组、模型组、a-BTX组、SIN组、Nic组、Indo组、MTX组提取腹腔巨噬细胞,取滑膜、肺脏、肝脏、脾脏、胸腺、肾脏、淋巴结。免疫荧光检测腹腔巨噬细胞a7nAChR表达,RT-PCR、免疫组化检测滑膜、肺脏、肝脏、脾脏、胸腺、肾脏a7nAChR表达,western blot检测淋巴结α7nAChR表达,研究SIN对a7nAChR表达的影响。3.AIA模型发病进程中a7nAChR表达变化大鼠造模后分组为对照组、模型组、SIN组、MTX组,第0、6、12、18、24、30d分别检测AIA模型大鼠足趾肿胀度、血沉、关节炎评分;ELISA检测血清中TNF-a含量;Western bolt检测滑膜、肺脏、肝脏、脾脏、胸腺、肾脏、淋巴结a7nAChR表达。4.SIN对FLS的增殖及a7nAChR表达的影响取正常大鼠膝关节滑膜用组织块法分离培养FLS,流式细胞术检测CD90鉴定FLS。细胞设对照组、TNF-a组、SIN低、中、高组(剂量分别为100,200,400μmol/L),SIN各组给予SIN干预30min后,TNF-a组、SIN各组再给予20ng/mL TNF-a刺激24h,MTT法检测细胞增殖;ELISA检测上清IL-6浓度;RT-PCR、Western bolt检测a7nAChR、TLR2和TLR4mRNA、蛋白表达。研究结果:1.SIN抗关节炎作用和a7nAChR的关系SIN、Nic、Indo、MTX均可抑制AIA模型大鼠足趾肿胀、降低关节炎评分、血沉和血清TNF-a含量。a-BTX拮抗SIN、Nic的作用,但不拮抗Indo、MTX的作用。与Nic类似,SIN抗关节炎作用能被a-BTX拮抗的结果提示SIN可能通过作用于a7nAChR发挥抗关节作用。2.SIN对大鼠AIA模型a7nAChR表达的影响SIN和Nic对大鼠各脏器a7nAChR的表达影响不尽相同。SIN对大鼠腹腔巨噬细胞、肝脏、滑膜、胸腺、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结的a7nAChR表达均下调。而Nic下调大鼠腹腔巨噬细胞、肝脏、滑膜a7nAChR表达;上调胸腺、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结等a7nAChR表达。Indo、MTX、a-BTX对各组织a7nAChR表达没有明显影响。3.a7nAChR表达变化与AIA模型发病进程的关系造模后第0、6天AIA大鼠各指标与对照组大鼠相比无明显差异。第12d,AIA大鼠RA相关指标(足趾肿胀、关节炎评分、血沉、血清TNF-a)与各组织a7nAChR表达均出现明显升高,18d达到峰值,18-30d相关指标逐渐降低,第30d相关指标仍然高于对照组大鼠。结果显示AIA大鼠各组织a7nAChR表达与足肿胀、关节炎评分具有高度正相关性。SIN不仅改善RA相关指标,还降低a7nAChR表达。Nic能影响a7nAChR表达,但对不同组织部位的影响不同。而MTX能降低RA进程相关指标,但对a7nAChR表达无影响。4.SIN对FLS的增殖及a7nAChR表达的影响TNF-a刺激FLS后,细胞增殖明显,IL-6浓度明显升高,a7nAChR、TLR2和TLR4 mRNA及蛋白表达上调。SIN中、高组(200,400μmol/L)明显抑制FLS增殖,抑制IL-6分泌,并且下调a7nAChR、TLR2和TLR4mRNA及蛋白表达。SIN低组无明显作用。结论:1.SIN作用于a7nAChR对大鼠AIA模型发挥抗关节炎作用,a7nAChR是SIN在体内发挥抗炎作用的重要靶点。2.SIN对AIA模型大鼠不同组织器官a7nAChR表达均起到下调作用。3.AIA模型发病进程中a7nAChR表达与足趾肿胀度和关节炎评分呈正相关。4.TNF-a促进FLS增殖,上调a7nAChR表达。且SIN能抑制FLS增殖,并下调a7nAChR 表达。