药物在体内经吸收、分布之后,可经药物代谢酶催化生成代谢产物,产生药理或毒理作用,研究药物代谢对明确其代谢途径和代谢机制具有重要的指导意义。肝脏是参与药物代谢的重要器官,富含药物代谢酶,是药物发生I相和II相代谢反应的主要场所。肝微粒体是肝内代谢酶的主要来源,包含催化I相代谢的CYP450酶和II相代谢的UGTs等酶类。其代谢模型操作简单、价格合理、储存方便,现被广泛应用于体外药物代谢的研究中。近年来,随着中药现代化研究及药物分析技术的发展,对中药单体成分特别是对中药有效成分的代谢研究逐渐成为人们关注的热点。本研究选取中药白芷主要成分香豆素类化合物蛇床夫内酯及中药芫花主要成分黄酮类化合物羟基芫花素和芫花素,利用高分辨质谱及液质联用技术,采用人肝微粒体温孵、重组酶温孵及化学抑制剂试验等方法,对三个单体成分在人肝微粒体中的代谢进行研究并对代谢表型进行鉴别,推测可能的代谢途径并进行比较,为进一步理解其代谢机制提供依据和技术支持。第一部分蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素在人肝微粒体中的代谢产物鉴定目的:本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,建立蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素的人肝微粒体体外温孵模型,对其在人肝微粒体中的代谢产物进行结构推断和鉴定,并归纳总结其代谢途径,为进一步阐明其体内过程提供理论依据。方法:通过向含有人肝微粒体的温孵体系中加入NADPH和UDPGA作为反应启动因子,建立I相代谢、葡萄糖醛酸化代谢及级联代谢反应的温孵模型。建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法对蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素在人肝微粒体温孵样品中的各类代谢产物进行检测,将采集到的高分辨质谱数据借助Peakview 1.2和Metabolite Pilot 1.5数据分析软件进行分析,总结三个化合物的质谱裂解规律,推测代谢产物结构并推断其代谢途径。结果:采用蛇床夫内酯对照品对温孵样品内的原型药物进行确证,正离子模式下,蛇床夫内酯主要脱去异戊烯基形成m/z 233的特征碎片离子,而后连续丢失CO,符合香豆素类化合物的一般裂解规律。通过与空白组和对照组温孵样品比较,在温孵样品中共鉴定出24个蛇床夫内酯的I相代谢产物,分别为蛇床夫内酯经氧化、与水加成、羧基化和脱氢作用生成。其中加氧后的羟基化代谢物M1、M2和环氧化代谢物M3为蛇床夫内酯在人肝微粒体中最主要的代谢产物。但是未检测到蛇床夫内酯及其I相代谢物的葡萄糖醛酸化代谢产物,可能与其结构中不含易与葡萄糖醛酸发生II相结合反应的活泼H有关。采用羟基芫花素和芫花素对照品对温孵样品内的原型药物进行确证,负离子模式下,羟基芫花素和芫花素主要发生黄酮类化合物特征性的RDA裂解。通过与空白组和对照组温孵样品比较,在羟基芫花素温孵样品中共发现10个代谢产物,其中包括3个I相代谢产物、3个葡萄糖醛化产物和4个级联反应产物。在芫花素温孵样品中共发现19个代谢产物,其中包括7个I相代谢物、2个葡萄糖醛酸化代谢物和10个级联反应代谢物。两化合物经去甲基和氧化引入羟基,而后与葡萄糖醛酸结合,II相代谢为其主要代谢反应类型。结论:三种单体成分均发生Ⅰ相代谢反应,引入羟基等极性基团,代谢产物极性增大,黄酮类成分羟基芫花素和芫花素更能与葡萄糖醛酸结合发生Ⅱ相代谢反应,葡萄糖醛酸化代谢产物极性进一步增加,更易于排出体外。第二部分蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素在人源CYP450酶中的代谢表型鉴定目的:本试验应用HPLC-Q-TRAP-MS/MS和UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,分别采用肝微粒体结合选择性化学抑制剂和c DNA重组酶孵育法,对参与蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素在人肝微粒体中代谢的CYP450酶表型进行鉴定,为阐明其代谢机制和临床安全合理用药提供理论依据。方法:将蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素与CYP450酶各亚型的选择性化学抑制剂在人肝微粒体中共同孵育,对三个单体成分反应后的剩余量进行测定,然后与不加入化学抑制剂的阴性对照溶液比较,考察化学抑制剂对三个单体成分代谢转化率的影响。建立蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素与CYP450各亚型重组酶的温孵体系,测定CYP450重组酶温孵样品中三个单体成分反应后的剩余量,与加入灭活肝微粒体的对照组相比,应用底物消除法评价CYP450酶对药物清除的贡献。结果:蛇床夫内酯化学抑制剂试验结果显示,其代谢转化率随着CYP1A2和CYP3A4的选择性抑制剂α-萘黄酮和酮康唑浓度的增加有较为显著的下降。与CYP450重组酶的温孵反应中,随着反应时间的增加,重组酶CYP1A2和CYP3A4温孵体系中蛇床夫内酯的消较为明显,而其他亚型组含量变化较小。CYP1A2和CYP3A4能够催化蛇床夫内酯生成其主要单氧化代谢产物M1、M2和M3。羟基芫花素和芫花素的代谢转化率均随CYP1A2、CYP2C9和CYP2C19的选择性抑制剂α-萘黄酮、磺胺苯吡唑和盐酸噻氯匹定浓度的增加有明显下降,以CYP2C9最为显著。与CYP450重组酶的温孵反应中,随着反应时间的增加,重组酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4可催化羟基芫花素和芫花素代谢消除。CYP1A2和CYP3A4可同时催化去甲基和单氧化反应,CYP1A2的催化活性高于CYP3A4。CYP2C9和CYP2C19主要介导羟基芫花素的去甲基化代谢,以CYP2C9的催化活性最高。结论:蛇床夫内酯、羟基芫花素和芫花素均可经CYP1A2和CYP3A4催化生成主要的氧化代谢产物,CYP2C9和CYP2C19在催化羟基芫花素和芫花素去甲基化反应中发挥重要作用,代谢表型的鉴定也为进一步研究药物在生物体内的生物转化及预测药物相互作用提供了理论依据。第三部分羟基芫花素和芫花素在人源UGT酶中的代谢表型鉴定目的:应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,采用人肝微粒体UGT重组酶孵育法,对参与羟基芫花素和芫花素在人肝微粒体中代谢的UGT酶表型进行鉴定,为阐明其代谢机制和临床安全合理用药提供理论依据。方法:建立羟基芫花素和芫花素与UGT重组酶的温孵体系,通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法测定温孵样品中葡萄糖醛酸化代谢物的生成量,并比较葡萄糖醛酸化代谢产物在各UGT亚型酶中的生成情况。结果:试验结果表明,UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7可参与羟基芫花素和芫花素在人肝微粒体中的葡萄糖醛酸化代谢;UGT1A1和UGT1A9可介导两个黄酮类化合物A环5-羟基和B环3’-和4’-羟基葡萄糖醛酸化,且催化活性较高;而UGT1A3、UGT1A10和UGT2B7只介导B环羟基参与反应,且以UGT1A10催化活性最高。结论:羟基芫花素和芫花素的葡萄糖醛酸化代谢可经UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7介导,推测UGT1A1、UGT1A9和UGT1A10为参与羟基芫花素和芫花素葡萄糖醛酸化代谢的主要UGT酶。第四部分蛇床夫内酯对人肝CYP450酶的抑制作用目的:采用探针底物法,根据FDA指导原则选择细胞色素P450酶亚型特异性探针底物,研究蛇床夫内酯对人肝CYP1A、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4这7种CYP450酶亚型的影响。方法:应用体外肝微粒体温孵体系,建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法,测定各亚型特异性探针底物生成代谢产物的含量,采用Graph Pad Prism 6.0软件进行非线性拟合并计算IC50值,从而评价蛇床夫内酯对CYP450酶7个亚型的体外潜在抑制作用。结果:蛇床夫内酯与CYP450酶各亚型探针底物共同孵育结果显示,蛇床夫内酯可对CYP3A4产生中等强度抑制作用,IC50=6.61μmol·L^-1;对CYP2C9和CYP2C19产生弱抑制作用,IC50值分别为20.09和17.49μmol·L^-1;对于CYP1A、2B6、2C8和2D6基本不存在抑制作用,IC50均大于100μmol·L^-1。结论:蛇床夫内酯可对CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4产生抑制作用,与经这3个CYP450亚型酶代谢的药物合用时可能因其对酶的抑制作用造成药物蓄积,使血药浓度升高,因此需要在联合用药时多加注意。第五部分蛇床夫内酯在人肝微粒体中的酶促反应动力学研究目的:研究蛇床夫内酯在人肝微粒体中的酶促反应动力学,优化温孵试验反应条件,并计算其酶促反应动力学参数。方法:考察温孵时间、蛋白浓度和底物浓度对温孵体系的影响。以磺胺甲噁唑为内标,Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm,5μm）,甲醇和1 mmol·L^-1乙酸铵水溶液为流动相,进行梯度洗脱,电喷雾离子源（ESI源）,正离子模式下MRM监测,测定人肝微粒体温孵样品中蛇床夫内酯的含量。采用Linewrave-Burk作图法处理数据,计算酶促动力学参数Km和Vmax。结果:蛇床夫内酯在人肝微粒体体系中最佳温孵时间为60 min,蛋白浓度为1 mg·m L^-1,底物浓度为30μmol·L^-1。Km=48.75μmol·L^-1,Vmax=0.5068μmol·（min·mg protein）^-1。结论:该方法简单、可靠,适用于蛇床夫内酯在肝微粒体体系中的测定。蛇床夫内酯是一个肝代谢药物,细胞色素P450酶作为主要酶系参与其生物转化。