研究背景和目的卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一,其发病率居妇科肿瘤第三位。然而卵巢癌的死亡率高居妇科肿瘤首位,5年生存率仍然徘徊在30%左右。近年来,基因治疗、靶向治疗作为肿瘤治疗的新生代模式日益受到重视。通过基因芯片和蛋白质组技术在卵巢癌研究中的应用发现了很多潜在价值的标志物。但目前还没有找到特有效的特异性标志物,对于生长转移的分子机理也缺乏一定的了解。转移是影响卵巢癌患者治疗效果和死亡的主要原因,探讨与卵巢癌生长转移相关的因素,寻找预防和治疗的有效途径,是当代肿瘤学研究的一项迫切任务。肿瘤血管化是肿瘤从体积小、局限性的非浸润性肿瘤发展成为体积大、具有浸润性和转移能力的肿瘤的关键步骤。抗血管生成是不同于常规抗肿瘤治疗的新策略,并以成为肿瘤研究的热点之一。最近研究阐明了微量的骨髓来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)参与肿瘤的血管发生,促进肿瘤生长,是肿瘤转移的开关。分化抑制因子1(inhibitors of differentiation 1, Id1)又称DNA结合抑制因子(inhibitors of DNA binding),属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HL H)转录因子家族,它显性负调控碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子活性,从而抑制细胞分化,促进细胞增殖。研究表明,Id1在人体肿瘤标本及体外培养的肿瘤细胞中均呈过表达。Schindl等检测了卵巢癌中Id1的表达,结果表明,卵巢癌的恶性程度与Id1的表达水平呈正相关。Lyden等的研究首次表明,Id1和Id3在与血管生成相关的VEGF信号转导途径中起关键作用,提示Id1与肿瘤的血管新生有关。Id1敲除的小鼠由于骨髓相关的血管生成缺陷,表现破坏肿瘤生长。而EPCs来源于骨髓,并参与新血管形成,所以EPCs与Id1关系很密切。最近研究报道肿瘤诱导Id1表达于骨髓来源的EPCs,而在骨髓中的其它细胞不表达,因此Id1对于EPCs功能是很重要的。骨髓中Id1缺失导致外周血EPCs数量减少,以至于阻止肿瘤血管生成和延缓肿瘤生长,外周血EPCs的数量与EPCs的生物学功能及动员机制有关。所以Id1可能介导肿瘤EPCs的动员和归巢,但具体机制还不十分清楚。既往研究表明多种因素如细胞因子(VEGF/EPO/SDF-1)、他汀类药物及基因转染(VEGF/SDF-1)等可以明显改善EPCs生物学功能,动员其至外周血,增加局部区域EPCs数量,改善缺血组织血管新生、修复损伤血管内皮。EPCs体内外调控机制复杂,涉及多种信号通路。本研究重点探讨Id1基因对卵巢癌EPCs增殖、黏附、迁移及血管生成的影响和作用机制,阐明Id1在卵巢癌生长转移中的主要生物学功能,为卵巢癌生长转移的病程监测和治疗奠定理论基础。方法1.卵巢癌患者EPCs水平的检测及临床意义选择经临床及病理检查确诊的卵巢癌患者42例,健康对照者25例,用流式分析仪测定其外周血EPCs水平；并通过荧光定量PCR对EPCs标记物CD34和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)基因进行检测；同时用ELISA检测了血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的蛋白水平。2.卵巢癌患者EPCs中Id1的表达及其EPCs的生物学特性密度梯度离心法分离25例卵巢癌患者和20例健康对照组外周血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞,采用荧光显微镜鉴定FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs;同时检测了内皮细胞标记物VEGFR2、CD31和vWF的表达；通过流式细胞仪检测细胞表型；利用荧光定量PCR和Western blot方法进行卵巢癌组和健康对照组的EPCs中Id1表达水平检测；利用MTT比色法检测EPCs增殖、体外黏附实验检测EPCs黏附基质和内皮细胞的能力、Transwell小室法检测迁移以及Matrigel法检测血管生成的能力。3.慢病毒携带shRNA对卵巢癌EPCs中Id1表达的抑制作用以及对EPCs生物学特性的影响利用在线软件设计3个位点的Id1干扰序列。采用慢病毒载体系统由pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成,构建目标基因Id1的慢病毒shRNA表达载体,经测序验证,在293T细胞中包装病毒粒子,病毒包括4种,目标基因Id1的Id1-1、Id1-2和Id1-3以及阴性对照Id1-NC。分别对这4个病毒粒子进行滴度测定。我们采用体外培养的人卵巢癌细胞株SKOV-3进行有效靶点的筛选。然后对卵巢癌EPCs进行感染,利用荧光定量PCR、Western blot方法进行各感染组的Id1表达水平检测。在有效沉默EPCs中Id1的基础上,MTT比色法检测慢病毒载体转染后,Id1对EPCs体外增殖的影响、黏附实验检测Id1对EPCs黏附基质和内皮细胞能力的影响、以及Transwell小室法检测Id1对EPCs迁移能力的影响及利用Matrigel法检测Id1对EPCs血管生成功能的影响。4.Id1对卵巢癌EPCs生物学特性影响的机制研究应用荧光定量PCR及western blot明确卵巢癌EPCs是否表达整合素α4；给予Id1的慢病毒shRNA表达载体后检测整合素α4的变化。用Western blot检测卵巢癌是否对EPCs中Akt蛋白磷酸化有影响,给予PI3K信号通路阻断剂LY294002,用Western blot检测EPCs中Akt蛋白磷酸化、Id1以及整合素α4的水平变化；同时观察LY294002对EPCs增殖、黏附和迁移以及血管生成能力的影响。结果1.卵巢癌患者EPCs水平以及临床意义卵巢癌患者治疗前外周血EPCs水平,显著高于健康对照组的,差异有统计学意义(t=21.906,P<0.01)；且治疗前后比较也有显著差异(t=15.922,P<0.05)。Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者外周血EPCs水平,高于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者外周血EPCs水平,两者相比较,差异有统计学意义(t=-6.109,P<0.05)。残留肿瘤直径大于2cm的EPCs水平明显高于残留肿瘤小于2cm的EPCs水平(t=-7.449,P<0.05)。卵巢癌患者治疗前后CD34水平与健康对照组比较无明显差异,VEGFR2治疗前水平和健康对照组比较有明显差异(t=-8.698,P<0.05)；卵巢癌患者治疗前血浆中VEGF、MMP-9水平显著高于健康对照组水平两者比较差异显著(t=13.015和14.355,P<0.01),治疗后VEGF和MMP-9的水平显著下降,和治疗前比较有差异(t=7.871和8.634,P<0.05)。血浆VEGF、MMP-9水平分别与卵巢癌治疗前EPCs水平均呈正相关,r=0.883(P<0.01)和0.865(P<0.01)。2.人外周血EPCs的分离、培养和鉴定卵巢癌患者和健康对照组外周血EPCs经过分离、培养7天后,形态上细胞出现梭形,内皮样外观,有的出现细胞集落,无铺路石样形成。进行免疫荧光染色后,荧光显微镜下观察并计数能摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-I双阳性细胞数量,90%以上的细胞双染色阳性,说明这些细胞是正在分化的EPCs:同时VEGFR2、CD31和vWF的荧光染色阳性结果也可达到80%以上,进一步证实有内皮细胞特征。细胞表型鉴定通过流式细胞仪检测贴壁细胞表面标志,结果显示表达CD34：8.32±1.49%,VEGFR2:80.37±4.03%。CD34表达低,结合国内外文献报道,我们培养的细胞可定义为早期EPCs。3.卵巢癌患者EPCs中Id1的水平检测以及EPCs生物学特性应用荧光定量PCR和Western blot检测EPCs中Id1基因和蛋白的表达,发现卵巢癌患者组Id1高表达,和健康对照组比较有显著性差异(t=6.047,P<0.01)。MTT比色法观察体外EPCs的增殖情况,结果表明两个组细胞的增殖能力差异有统计学意义(t=5.806,P<0.01)；粘附能力实验观察体外EPCs的粘附能力,黏附基质结果表明两个组EPCs的粘附能力差异有统计学意义(t=17.682,P<0.01)。和内皮细胞之间的黏附力检测结果表明两个组EPCs的粘附能力差异有统计学意义(t=12.243,P<0.01)。迁移能力的检测结果表明两个组EPCs的迁移能力差异有统计学意义(t=16.869,P<0.01)。血管生成能力两个组差异有统计学意义(t=15.734,P<0.01)。4.通过RNAi技术沉默卵巢癌EPCs中Id1表达以及对EPCs生物学特性的影响构建了三个干扰Id1基因表达的慢病毒干扰载体,将慢病毒质粒和阴性质粒共转染293T病毒包装细胞,收获病毒上清,测定病毒滴度为2×109Transducing Unit(TU)/ml。利用Id1慢病毒干扰载体感染SKOV-3细胞,荧光定量PCR和Western blot结果发现Id1-3的慢病毒干扰载体的干扰效率最高(80%)。利用含干扰片段Id1-3的慢病毒和空载体病毒感染EPCs细胞,荧光定量PCR和Western blot结果发现Id1表达明显降低(F=20.198,P<0.01)。MTT法观察体外Id1-3慢病毒和空载体病毒感染的EPCs的增殖情况,结果表明Id1干扰组增殖能力低于卵巢癌组,差异有统计学意义(F=13.078,P<0.05)；粘附基质和内皮细胞能力实验结果都表明Id1干扰组EPCs的粘附能力明显低于卵巢癌组细胞的粘附能力,差异有统计学意义(F=193.982和56.007,P<0.01)。迁移能力的检测结果表明Id1干扰组EPCs的迁移能力低于卵巢癌组,差异有统计学意义(F=108.045,P<0.01)。血管生成能力两个组差异有统计学意义(F=48.950,P<0.05)。5.Id1对卵巢癌EPCs生物学特性影响的机制研究应用荧光定量PCR和Western blot检测卵巢癌患者和健康对照组EPCs中整合素α4基因和蛋白的表达,发现卵巢癌患者组整合素α4高表达,和健康对照组比较有显著性差异(t=6.520,P<0.01)。利用含Id1干扰的慢病毒和空载体病毒感染EPCs细胞,荧光定量PCR和Western blot结果发现整合素α4表达降低(F=24.208,P<0.05)。应用Western blot检测卵巢癌患者和健康对照组EPCs中Akt蛋白磷酸化的水平,发现卵巢癌患者组Akt蛋白磷酸化高表达,和健康对照组比较有显著性差异(t=11.095,P<0.01)。给予PI3K信号通路阻断剂LY294002,用Western blot检测EPCs中Akt蛋白磷酸化、Id1以及整合素α4的水平变化；结果发现EPCs中Akt蛋白磷酸化、Id1以及整合素α4的水平降低,和卵巢癌组比较有统计学意义(P<0.05)。同时给予LY294002组EPCs的增殖能力降低,和卵巢癌组比较有统计学意义(F=13.078,P<0.05)；黏附基质和内皮能力两组比较均有统计学意义(F=193.982和F=56.007,P<0.05)；以及迁移能力(F=108.045,P<0.05)和血管生成能力都有不同程度的降低(F=48.950,P<0.05)。结论1.卵巢癌患者外周血的EPCs水平可以作为监测病程,血管新生或反映疗效的一个有效的实验诊断指标。2.研究发现在卵巢癌患者的外周血EPCs中Id1水平呈现高表达。并且卵巢癌患者EPCs的增殖能力、细胞粘附能力,迁移和血管生成能力都高于健康正常人。这-结果表明Id1基因的高表达及伴随出现的EPCs增强的生物学功能在卵巢癌的发生发展过程中,尤其是肿瘤的血管新生以及加速生长和转移方面起着重要的作用。3.成功地构建了人Id1基因RNAi慢病毒载体,克隆出Id1-1、Id1-2、Id1-3和Id1-NC四个干扰载体,进行慢病毒的包装和滴度测定,荧光定量PCR、Western blot显示其中Id1-3位点Id1干扰效果最好。用Id1-3和Id1-NC位点的慢病毒感染EPCs降低了体外EPCs增殖能力、细胞粘附能力,迁移和血管生成能力,提示Id1表达沉默的EPCs有望成为降低卵巢癌血管新生的一种全新基因修饰的细胞治疗载体。4.Id1可能通过多条信号通路来介导它在卵巢癌EPCs中的作用,在相互作用的基因中PI3K/Akt、整合素α4与Id1关系密切,Id1通过整合素α4加速卵巢癌EPCs的迁移和黏附功能,而PI3K/Akt信号通路参与了Id1影响卵巢癌EPCs的增殖、黏附、迁移和血管生成功能。主要创新点1.观察外周血EPCs水平可以作为卵巢癌的一个生物标记物,对监测病程、判断预后和是否转移方面将具有重要的临床意义。2.探讨Id1的高表达及伴随出现的EPCs增强的生物学功能在卵巢癌的血管新生以及加速生长和转移方面起着重要的作用,国内外未见相关报道。3.利用RNAi技术沉默人Id1基因,获得了一个新的Id1基因沉默的有效位点,为成功构建人Id1RNAi慢病毒载体以及检测Id1RNAi慢病毒载体对卵巢癌EPCs生物学特性的影响提供有力的依据。4.首次提出Id1通过PI3K/Akt以及整合素α4信号通路参与Id1影响卵巢癌EPCs的生物学特性。为抗卵巢癌血管新生及生长转移提供新的基因治疗靶点,为研制和开发针对Id1因子的药物治疗卵巢癌提供了实验依据。