第一部分 IL-21在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的表达规律及作用目的：免疫系统激活在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中发挥的重要作用已得到广泛证实。IL-21是一种多效性细胞因子,其在MIRI中的作用尚不明确。本部分实验旨在研究IL-21及其受体在小鼠MIRI中的表达规律,并探讨IL-21对MIRI的作用。方法：通过结扎冠状动脉左前降支构建小鼠MIRI模型,通过real-time PCR和western blot检测缺血再灌注后不同时间点(30 min、1 h、6 h、12 h、24 h)心肌组织IL-21及受体特异链IL-21R的表达水平。为明确IL-21在MIRI中的作用,在再灌注前给予IL-21中和性抗体或重组小鼠IL-21对MIRI模型进行预处理以阻断或增强IL-21的效应,于再灌注1天时检测MIRI相关各项指标的改变,包括Even’s blue/TTC双染色法测定心肌梗死面积、血清肌钙蛋白(TnT)检测心肌损伤以及心脏超声测定左室射血分数(EF)和左室缩短分数(FS)评价心功能。结果：与假手术组相比,再灌注后30 min小鼠心肌组织中IL-21 mRNA和蛋白表达均开始升高,并持续至再灌注后24 h。IL-21受体特异链IL-21R mRNA和蛋白表达均在再灌注后12h开始升高,并持续至24 h。与同型对照抗体组相比,中和IL-21的作用能够缩小梗死面积、降低血清TnT水平及改善心功能。与之相反,外源性给予重组IL-21则明显增加心肌梗死面积、升高血清cTnT水平,并使心功能损伤加重。结论：IL-21及其受体在小鼠MIRI后早期表达上调;中和内源性IL-21可减轻MIRI,而外源性IL-21干预则会加重MIRI。第二部分I L一21通过募集中性粒细胞浸润参与心肌缺血再灌注损伤目的：以往研究表明,MIRI后大量中性粒细胞浸润及其介导的炎症反应是加重MIRI的重要机制之一。本部分实验旨在探讨IL-21是否影响MIRI后中性粒细胞浸润,及其相关机制。方法：8-12周龄雄性C57B/L6小鼠随机分为假手术组、MIRI对照组、MIRI外源性IL-21干预组,应用流式细胞术定量检测再灌注3h后局部心肌组织中性粒浸润的数目：Real-time PCR检测心肌组织ELR+CXC趋化因子KC、MIP-2和LIX的表达。体外分离培养C57B/L6小鼠乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞,给予IL-21刺激后通过real-time PCR检测KC和MIP-2 mRNA表达,ELISA检测细胞培养上清中KC和MIP-2的浓度。体外分离成年C57B/L6小鼠骨髓中性粒细胞,与有或无IL-21刺激的心肌细胞或心脏成纤维细胞培养上清分别置于transwell上、下小室中,检测中性粒细胞迁移活性。结果：流式细胞术定量分析显示,与假手术组相比,MIRI组小鼠心肌组织中性粒细胞浸润数目增加,而给予外源性IL-21干预进一步增加了心肌组织中性粒细胞浸润程度。给予外源性IL-21上调了再灌注后30 min和3h心肌组织KC、MIP-2 mRNA表达,而不影响LIX表达。体外实验中,给予IL-21刺激1h后,心肌细胞、心脏成纤维细胞KC和MIP-2 mRNA表达均较对照组明显升高；给予IL-21刺激24 h后,两种细胞培养上清中KC、MIP-2浓度亦明显升高。中性粒细胞趋化实验结果显示,IL-21刺激心肌细胞、心脏成纤维细胞后的条件培养上清能够促进中性粒细胞迁移。结论：IL-21可能通过上调心肌细胞和心脏成纤维细胞中趋化因子KC和MIP-2的表达,促进中性粒细胞迁移,进而介导MIRI后心肌组织局部中性粒细胞浸润。第三部分 IL-21促进心肌缺血再灌注损伤和中性粒细胞浸润的分子机制目的：以往研究表明,JAK-STAT(主要是STAT1和STAT3)、PI3K/Akt、ERK、p38 MAPK和NF--kB等信号通路参与了IL-21在不同细胞类型的不同生物学效应；同时,上述信号通路也在MIRI的调控中发挥重要作用。本部分实验通过在组织学和细胞学水平分别探讨IL-21对上述信号通路激活的效应,以期阐明IL-21诱导心肌细胞、心脏成纤维细胞趋化因子表达,促进中性粒细胞浸润并介导心肌损伤的分子机制。方法：8-12周龄雄性C57B/L6小鼠构建MIRI模型,取假手术组和MIRI再灌注不同时间点(10 min、30 min、60 min、120 min)心肌组织,western blot检测ERK、p38 MAPK、 Akt、 NF-kB p65、 STAT1和STAT3通路激活的时间规律。构建小鼠MIRI模型,分为对照组和IL-21干预组,分别于再灌注后10min、30min通过western blot检测IL-21对各信号通路关键分子磷酸化程度的改变。离体分离培养小鼠乳鼠心肌细胞、心脏成纤维细胞,western blot检测IL-21刺激不同时间点(10 min、30 min、60 min、120 min)各信号通路磷酸化改变。为进一步明确IL-21处理后发生激活的信号通路是否为调控趋化因子表达的信号机制,于IL-21刺激两种细胞前分别给予相应信号通路阻滞剂预处理,real-time PCR和ELISA分别检测KC、MIP-2mRNA表达和分泌的改变。结果：在小鼠MIRI模型中,再灌注10 min时ERK、p38 MAPK和NF-κB p65即开始激活,而Akt、STAT1和STAT3在再灌注30 min后开始激活。进一步在再灌注10 min、30 min两个时间点分别检测在体IL-21干预对各信号通路激活的影响。结果显示,再灌注10 min时,IL-21增强了p38 MAPK的激活效应；再灌注30 min时,IL-21可同时激活p38 MAPK和NF-κB信号通路。然而,IL-21对其他信号通路关键分子并无明显激活效应。细胞水平上,心肌细胞在IL-21刺激10-30 min时表现为Akt激活,NF-κB p65是其下游信号分子,于30 min开始激活并持续至2 h。心脏成纤维细胞p38MAPK通路在IL-21刺激30 min后开始激活,而NF-κB p65于1h后开始激活。此外,IL-21处理心肌细胞、成纤维细胞后ERK、STAT1或STAT3通路均未见激活。在IL-21刺激前,心肌细胞给予PI3K/Akt阻滞剂或NF-κB阻滞剂预处理可显著抑制KC、MIP-2mRNA表达,其分泌被部分抑制。相似地,心脏成纤维细胞给予p38 MAPK阻滞剂或NF-κB阻滞剂预处理同样可显著抑制KC、MIP-2mRNA表达和分泌。结论：心肌细胞Akt/NF-κB信号通路和心脏成纤维细胞p38 MAPK/NF-κB信号通路的激活是IL-21诱导趋化因子KC、MIP-2表达上调的重要信号通路机制。