论文部分内容阅读
目的本研究探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对肾小管上皮细胞(TECs)自噬-溶酶体系统的影响,及其是否通过与RAGE受体的相互作用引发氧化应激而造成溶酶体损伤,为糖尿病肾病的治疗提供新思路。方法AGE-BSA(100μg/ml)刺激HK-2细胞12h后,加用或不加用溶酶体抑制剂用蛋白免疫印迹和免疫荧光检测LC3-II转化,研究AGEs对肾小管上皮细胞自噬活性的影响;运用免疫荧光共标记观察LAMP1和LC3-II共定位,检测AGEs对肾小管上皮细胞自噬泡与溶酶体融合的影响。AGE-BSA(100μg/ml)刺激HK-2细胞6、12、24h后,运用组织蛋白酶B(CB)、D、L试剂盒分别检测AGEs对HK-2细胞溶酶体组织蛋白酶的活性;免疫荧光和流式细胞术观察示踪红(TLR)荧光和DQ-卵清蛋白荧光,检测AGEs对肾小管上皮细胞溶酶体酸化程度和溶酶体消化功能的影响;运用免疫荧光共标记观察LAMP1和CB荧光,检测AGEs对肾小管上皮细胞溶酶体完整性(溶酶体膜通透化LMP)的影响。AGE-BSA(100μg/ml)刺激HK-2细胞,免疫荧光和流式细胞术观察阻断AGEs与抗体结合或抗氧化剂预处理对AGEs所致肾小管上皮细胞溶酶体酸化程度和溶酶体消化功能改变的影响,流式细胞术观察阻断AGEs与抗体结合或抗氧化剂预处理对AGEs所致肾小管上皮细胞ROS生成的影响。结果一、AGEs造成肾小管上皮细胞自噬通路受阻,自噬活性下降,AGE-BSA刺激12h后HK-2细胞LC3-II蛋白水平明显升高,但应用溶酶体抑制剂没有观察到LC3-II蛋白水平的额外增高。AGE-BSA刺激后HK-2细胞没有观察到LC3-II转化但LC3-II光点可以和不规则的分布的LAMP1光点相融合。二、AGEs刺激导致HK-2细胞组织蛋白酶B(CB)、L活性明显降低,示踪红荧光和DQ-卵清蛋白的荧光明显减弱。免疫荧光双标记溶酶体膜蛋白LAMP-1及CB,AGE-BSA刺激后溶酶体膜蛋白LAMP1在细胞内分布不规则,聚集呈粗大成团状分布,CB的光点变得分散而不规则,和LAMP1没有明显的共定位,CB散布于LAMP1外。三、AGE-BSA刺激使HK-2细胞使示踪红荧光和DQ-卵清蛋白的荧光明显减弱。这种减弱可以被RAGE中和抗体或抗氧化剂预处理部分抑制;AGE-BSA刺激HK-2细胞ROS产生明显增加。抗氧化剂NAC和catalase或抗RAGE中和抗体预处理均可以抑制AGE-BSA刺激HK-2细胞所导致的ROS产生。结论本研究发现,在糖尿病肾病状态下,AGEs通过RAGE/ROS通路介导了肾小管上皮细胞溶酶体损伤,导致自噬通路受阻,调控RAGE/ROS可以保护溶酶体,通畅自噬-溶酶体通路。