目的：探讨川芎嗪主动靶向纳米粒逆转肿瘤细胞多药耐药作用与机制。方法：1.离子交联法制备主动靶向纳米粒制剂：以川芎嗪为目标药物，叶酸偶联壳聚糖为载体材料，多聚磷酸钠负离子为物理诱导剂，采用离子交联法制备叶酸修饰的川芎嗪纳米粒（主动靶向纳米粒），并制备川芎嗪纳米粒（被动靶向纳米粒）、空白纳米粒作为对照。2.川芎嗪主动靶向纳米粒的细胞毒作用检测：应用MTT法检测川芎嗪主动靶向纳米粒的细胞毒作用，将不同浓度主动靶向纳米粒作用于叶酸受体表达较高的人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM和叶酸受体表达较低的人白血病耐药细胞K562/ADM，分别给药24，48，72h后，加入MTT，孵育4h， DMSO充分溶解甲瓒结晶，酶标仪检测波长为492nm处吸光度值。采用Origin软件绘制细胞生长曲线，分别计算给药24h后，川芎嗪主动靶向纳米粒作用于MCF-7/ADM细胞的IC95（低剂量）、IC85（中剂量）和IC80（高剂量），并计算K562/ADM细胞的IC95。3.实验分组与给药方案采取低剂量即无毒剂量逆转剂联合阿霉素（5μg·mL-1）给药方案，实验分组如下：空白对照组：空白培养基组；实验组：主动靶向纳米粒组；实验对照组：被动靶向纳米粒组；川芎嗪溶液组；空纳米粒组；主动靶向纳米粒组（不含阿霉素）；阿霉素组；阳性对照组：维拉帕米（10μg·mL-1）组。4.川芎嗪主动靶向纳米粒逆转肿瘤细胞多药耐药作用研究：采用MTT法检测叶酸主动靶向纳米粒逆转肿瘤细胞多药耐药作用。取对数生长期MCF-7、MCF-7/ADM、K562、K562/ADM细胞按3项下方法进行分组，给药24h后，加入MTT孵育4h，DMSO充分溶解甲瓒结晶，酶标仪检测波长为492nm处吸光度值。计算各给药组细胞存活率，比较各给药组逆转肿瘤细胞多药耐药作用。5.细胞内阿霉素荧光强度检测：采用流式细胞技术和激光共聚焦显微镜技术检测细胞内阿霉素荧光强度。取对数生长期MCF-7/ADM细胞按3项下方法进行分组，给药24h后，采用流式细胞仪(flow cytometer，FCM)检测细胞内ADM荧光强度。另采用埋片法，取对数生长期MCF-7/ADM细胞按3项下方法进行分组，给药24h后，采用激光共聚焦显微镜拍照，比较各组荧光强度。6.细胞内阿霉素浓度检测：采用荧光分光光度法检测细胞内阿霉素浓度。以3mol·L-1的盐酸乙醇（60%）溶液为溶剂，配制不同浓度的阿霉素标准溶液，制备标准曲线，计算直线回归方程与相关系数。选取对数生长期MCF-7/ADM细胞按3项下方法进行分组，给药24h后，荧光分光光度计检测细胞内阿霉素荧光强度，并用直线回归方程计算各给药组细胞内阿霉素浓度。7.川芎嗪主动靶向纳米粒逆转作用的时间、剂量依赖性：将MCF-7/ADM细胞分为三组，各组分别给予高、中、低剂量川芎嗪主动靶向纳米粒，并同时给予无毒剂量ADM，给药1，6，12，24，48，72h后，采用荧光分光光度法检测细胞内阿霉素的荧光强度，并用上述直线回归方程计算各组细胞内阿霉素浓度。8. P-糖蛋白（P-gp）与GST-π酶表达情况的检测：P-gp与GST-π酶表达情况采用Western Blotting法进行检测。取对数生长期MCF-7/ADM细胞进行分组，给药24h后，IP裂解液提取胞膜总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，经一抗、二抗孵育后用5%脱脂牛奶封闭，ECL染色，紫外光下拍照，灰度分析软件检测细胞中P-gp与GST-π酶表达情况，并以β-actin为内参，计算P-gp与GST-π酶表达水平。9. MDR-1与GST-π酶基因表达情况的检测：MDR-1与GST-π酶基因的表达情况采用Real Time PCR法检测。选取对数生长期MCF-7/ADM细胞进行分组，给药24h后，RNAiso plus提取总RNA，进行反转录后，实时定量PCR检测MDR-1与GST-π酶基因表达情况，并以β-actin为内参，计算MDR-1与GST-π基因水平。结果：1.给药24，48，72h后，川芎嗪主动靶向纳米粒对MCF-7/ADM和K562/ADM细胞的细胞毒作用较低，随着给药时间的延长细胞的存活率有所降低。川芎嗪主动靶向纳米粒作用于MCF-7/ADM细胞的IC95、IC85和IC80分别为0.261mg·mL-1，0.503mg·mL-1和0.737mg·mL-1，作用于K562/ADM细胞的IC95为0.238mg·mL-1。2.对于叶酸受体高表达的MCF-7/ADM细胞，与阿霉素组比较，主、被动靶向纳米粒均能显著降低细胞存活率；主动靶向纳米粒组与被动靶向纳米粒组、川芎嗪溶液组相比较，细胞存活率明显降低，经统计学处理，存在显著性差异。与阳性对照组比较，无明显差异。对于叶酸受体表达较低的K562/ADM细胞，与阿霉素组比较，主、被动靶向纳米粒能显著降低细胞存活率，但主、被动纳米粒之间的差异无统计学意义。3.流式细胞仪检测结果显示川芎嗪主动靶向纳米粒能显著增加细胞内阿霉素荧光强度。对于MCF-7/ADM细胞，阿霉素单独给药组细胞内阿霉素荧光强度为175.27±11.25，主动靶向纳米粒组、被动靶向纳米粒组分别为237.38±13.46和212.78±15.85。阿霉素组相比较，主、被动靶向纳米粒组细胞内阿霉素荧光强度显著增强，并且主、被动向纳米粒之间的差异有统计学意义。在MCF-7细胞中，各组阿霉素荧光强度无明显差异。激光共聚焦显微镜下所拍摄的细胞形态与流式细胞仪检测结果一致。4.川芎嗪主动靶向纳米粒能显著增加细胞内阿霉素浓度。对于MCF-7/ADM细胞，给药24h后，阿霉素组细胞内阿霉素浓度为0.343±0.013μg·mL-1，主、被动靶向纳米粒组分别为0.716±0.016μg·mL-1和0.630±0.036μg·mL-1。与阿霉素组相比较，主、被动靶向纳米粒组细胞内阿霉素浓度显著增高，并且主、被动靶向纳米粒组之间存在显著性差异。5.川芎嗪主动靶向纳米粒与阿霉素同时给药24h内，细胞内阿霉素浓度随给药时间的延长而增加，具有一定的时间依赖性；给药24h后，细胞内阿霉素浓度随主动靶向纳米粒浓度的增加而增大，具有一定的剂量依赖性。6.与阿霉素组相比较，主、被动靶向纳米粒均能显著下调MCF-7/ADM细胞内耐药相关蛋白P-gp、GST-π酶及其基因MDR-1、GST-π的表达水平。并且主、被动靶向纳米粒组之间存在显著性差异。结论主动靶向纳米粒与被动靶向纳米粒组、川芎嗪溶液组相比较，具有良好的逆转MCF-7/ADM细胞多药耐药作用，这一作用可能是通过下调多药耐药相关蛋白P-gp、GST-π酶及其基因表达水平实现的。