研究背景与目的肺癌的发病率已成为恶性肿瘤之首，有关发生机理一直是研究的方向与热点。众多的研究表明，端粒是细胞衰老、死亡和癌变的重要标志，许多端粒蛋白参与了端粒结构稳定性的调控，当端粒蛋白不能保护端粒末端时，端粒酶得以将端粒重复序列TTAGGG加到端粒末端，造成细胞不朝衰老、死亡方向运动，而引起肿瘤。端粒重复序列结合因子(Telomeric Repeat Binding Factor 1，TRF1)就是端粒结合蛋白的一种，TRF1由439个氨基酸组成，分子量约60KD，研究结果表明TRF1是端粒延长的一个抑制因子，呈负反馈调节端粒的长度。TRF1与端粒DNA结合后，顺式抑制端粒酶的作用，从而控制端粒的长度。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体，具有逆转录酶的功能，能够将端粒重复序列TTAGGG加到染色体的末端。大量的恶性肿瘤细胞表达端粒酶，而大部分正常细胞不表达端粒酶。进一步的研究表明，TRF1对端粒酶的表达和活性没有影响，由此推测TRF1通过阻止端粒酶在端粒末端的作用来控制端粒长度。与TRF1密切相关的另一个端粒蛋白是端锚蛋白(Tankyrase 1，TANK1)，TANK1可以调节体内TRF1在端粒的聚集，在端粒酶阳性的细胞，TANK1长期过表达可使端粒长度进行性地延长，缺失PARP区域的TANK1对TRF1的分布和端粒长度的动力学无影响，因而TANK1可能是体内端粒延长的一种正调控因子，通过阻滞TRF1与端粒的结合发挥作用。根据“端粒长度调节的蛋白计数模型”，当TRF1减少至临界数目时，端粒中的TRF1向端粒酶提供的负反馈信号消失，端粒酶复合物激活，且脱落的TRF1为端粒酶与端粒的结合提供了入口，使激活的端粒酶结合到端粒上并催化合成端粒重复序列。随着端粒的延长，其结合的TRF1重新增至临界值，再次抑制端粒酶复合物与端粒的结合，维持了癌细胞端粒长度的稳定性，从而使癌细胞持续生长繁殖。综上所述，人类端粒的功能需要端粒蛋白的调控，TRF1具有抑制端粒酶复合物与端粒结合的作用，而TANK1能够清除端粒DNA上的TRF1。因此，TRF1和TANK1有可能成为抑制肿瘤的新靶点。基于以上的认识，我们首先对50例非小细胞肺癌(NSCLC)患者进行端粒酶表达的检测，筛选出端粒酶阳性表达的患者，在此基础上，分别检测TRF1在NSCLC患者癌组织及癌旁组织中转录水平、翻译水平表达的差异，并通过免疫组化了解TRF1在癌组织及癌旁组织中的细胞定位，进一步对预测的核定位序列进行检测。暨希望能通过对TRF1在NSCLC中的一系列检测研究，获得端粒结合蛋白在端粒网络调控中的一个切入点。第一部分TRF1及TANK1mRNA在端粒酶阳性的非小细胞肺癌中的表达研究目的对端粒酶表达阳性的NSCLC患者进一步检测TRF1、TANK1mRNA表达水平，并探讨其表达水平与临床病理特征的相关性。研究方法(1)研究对象2004年11月至2005年11月期间，收集NSCLC患者共50例，所有NSCLC病例均选自浙江大学医学院附属第一医院胸外科住院患者，并经病理切片证实；(2)对50例NSCLC患者首先进行免疫组化的端粒酶逆转录酶(TERT)检测，筛选出端粒酶阳性患者；(3)对端粒酶表达阳性的NSCLC患者，采用RT-PCR对TRF1、TANK1mRNA进行检测。结果(1)NSCLC中TERT免疫组化结果：TERT在细胞浆及细胞核均有表达，50例NSCLC患者的癌组织中TERT阳性表达例数为36例，阳性率为72.0％(36/50)。(2)端粒酶阳性表达的NSCLC患者的临床资料：36例患者端粒酶表达阳性，其中男性22例，女性14例；腺癌23例，鳞癌13例；(3)TRF1mRNA在癌组织及癌旁组织的表达：癌组织TRF1mRNA为1.101±0．119，相应的癌旁组织为2.015±2.337，经配对t检验，癌旁组织TRF1mRNA的表达水平明显高于癌组织，差异具有显著性(P=0.02)。(4)癌组织TRF1mRNA表达与病理组织学的关系：36例NSCLC患者中，肺腺癌23，肺鳞癌为13例。肺腺癌癌组织TRF1mRNA表达为1.075±0.823，肺鳞癌癌组织TRF1mRNA表达为1.149±0.514，经t检验，差异无显著性(P=0.773)。(5)癌组织TRF1mRNA表达与淋巴结转移的关系：36例NSCLC患者中，淋巴结阳性为19例，淋巴结阴性为17例。淋巴结阳性患者癌组织TRF1mRNA表达为0.893±0.619，淋巴结阴性患者癌组织TRF1mRNA表达为1.334±0.769，差异无显著性(P=0.070)。(6)癌组织TRF1mRNA表达与临床分期的关系：36例NSCLC中，Ⅰ期患者为9例，癌组织TRF1mRNA表达为1.198±0.619；Ⅱ期患者为9例，癌组织TRF1mRNA表达为1.337±0.939，Ⅲ期为16例，Ⅳ期患者为2例，两期合并统计，癌组织TRF1mRNA表达为0.936±0.637，经One-Way ANOVA分析，差异无显著性(P=0.364)。(7)癌组织TRF1mRNA表达与分化程度的关系：36例NSCLC患者中，分化程度高中度的为21例，TRF1mRNA表达为1.309±0.784；分化程度低的为15例，TRF1mRNA表达为0.811±0.510，差异有显著性(P=0.040)。(8)癌组织及癌旁组织中TANK1mRNA表达：TANK1mRNA在癌组织及癌旁组织均有表达，TANK1mRNA在癌组织表达为0.572±0.423，癌旁组织为0.430±0.336，癌组织中TANK1表达水平比癌旁组织明显增加，差异有显著性(P=0.04)。(9)癌组织中TANK1mRNA表达与临床病理特征的关系：经统计学分析，未发现癌组织中TANK1mRNA表达水平与性别、病理、淋巴结转移、分化程度、临床分期有统计学相关性(P＞0.05)。(10)癌组织中TRF1mRNA表达水平与TANK1mRNA表达水平的相关性分析：经Spearman相关性检验，未发现两者在转录水平上有统计相关性(r=0.098，p=0.605)。结论(1)NSCLC患者中，癌组织中的TRF1mRNA表达水平比癌旁组织中明显下降；(2)NSCLC患者中，癌组织中的TRF1mRNA表达水平与细胞分化程度相关，低分化的NSCLC患者TRF1mRNA表达水平比高中分化者明显降低；(3)NSCLC患者中，癌组织中的TANK1mRNA表达水平比癌旁组织中明显升高。第二部分TRF1蛋白在非小细胞肺癌中的表达研究目的检测TRF1蛋白在NSCLC中的表达水平，探讨TRF1蛋白表达水平与临床病理指标之间的关系。研究方法应用Western blot方法检测NSCLC患者癌组织及癌旁组织中TRF1蛋白表达水平。结果(1)TRF1蛋白在NSCLC癌组织及癌旁组织中的表达：36例NSCLC患者癌组织中TRF1蛋白表达阳性者为30例，癌旁组织表达阳性为33例，为了配对t检验，30例样本进入统计分析。(2)NSCLC患者TRF1在癌组织及癌旁组织的表达：30例NSCLC患者癌组织TRF1蛋白为0.552±0.329，相应的癌旁组织为0.652±0.476，经配对t检验，癌旁组织TRF1的蛋白表达水平明显高于癌组织，且差异具有显著性(P=0.028)。(3)癌组织TRF1蛋白表达水平与病理组织学的关系：30例NSCLC中，肺腺癌19，肺鳞癌为11例。肺腺癌癌组织TRF1蛋白表达为0.602±0.397，肺鳞癌癌组织TRF1蛋白表达为0.466±0.132，经t检验，差异无显著性(P=0.601)。(4)癌组织TRF1蛋白表达与淋巴结转移的关系：30例NSCLC中，淋巴结阳性者为15例，淋巴结阴性者为15例。淋巴结阳性患者癌组织TRF1蛋白表达为0.593±0.309，淋巴结阴性患者癌组织TRF1蛋白表达为0.512±0.354，差异无显著性(P=0.509)。(5)癌组织TRF1蛋白表达与临床分期的关系：30例NSCLC中，Ⅰ期患者为8例，癌组织TRF1蛋白表达为0.481±0.250；Ⅱ期患者为7例，癌组织TRF1蛋白表达为0.797±0.487，Ⅲ期为14例，Ⅳ期患者为1例，两期合并统计，癌组织TRF1表达为0.477±0.229，经One-Way ANOVA分析，差异无显著性(P=0.076)。(6)癌组织TRF1蛋白表达与分化程度的关系：30例NSCLC患者中，分化程度高中度的为16例，TRF1表达为0.481±0.148；分化程度低下的为14例，TRF1表达为0.634±0.451，差异无显著性(P=0.240)。(7) TRF1mRNA表达水平与TRF1蛋白表达水平的相关性检验：将其与相对应的TRF1mRNA的检测标本进行Spearman相关性检验，结果提示NSCLC中TRF1mRNA表达水平与TRF1蛋白表达水平无统计相关性(r=0.099，t=0.603，P＞0.05)。结论(1)NSCLC患者中，TRF1蛋白在癌组织中的表达水平比癌旁组织明显降低。(2)NSCLC患者中，癌组织的TRF1蛋白表达水平在不同病理分型、淋巴结转移、临床分期、分化程度方面的差异无显著性。第三部分TRF1蛋白在非小细胞肺癌中的免疫组化定位研究目的探讨TRF1蛋白在NSCLC中的细胞定位，为深入了解TRF1在NSCLC中的作用提供依据。研究方法免疫组化方法检测TRF1蛋白在NSCLC中的分布。结果TRF1蛋白阳性信号为细颗粒状或片状染色，不论癌组织或癌旁组织阳性表达均较弱，为局限性的表达，浅棕黄色染色．主要表达于细胞浆内，少量表达于细胞核内。TRF1蛋白在癌旁组织中的阳性表达率为50.0％，癌组织中为44.44％，差异无显著性(P＞0.05)；癌组织中核浆均阳性表达为22.22％，癌旁组织核浆均阳性表达为33.33％。差异无显著性(P＞0.05)；腺癌、鳞癌之间的TRF1表达阳性率无显著性差异(P＞0.05)。结论(1)免疫组化结果表明，NSCLC患者中肺癌组织的TRF1的阳性表达率为44.44％，癌旁组织为50.0％；(2)免疫组化结果表明，NSCLC患者中TRF1的表达主要在细胞浆中，部分呈浆、核表达双阳性。第四部分非小细胞肺癌中TRF1蛋白的核定位信号序列检测研究目的探讨TRF1蛋白在NSCLC中的细胞核定位信号序列是否存在碱基突变或缺失，为深入了解TRF1蛋白在NSCLC中的作用提供依据。研究方法PSORTⅡ程序预测TRF1蛋白的核定位信号，PCR扩增相应的序列，并进行测序。结果将NSCLC患者的肺癌组织、癌旁组织检测结果进行对比，核定位信号序列中未发现有突变或缺失的碱基。结论对预测的核定位信号序列进行测序，结果表明NSCLC患者中，未发现TRF1蛋白核定位信号序列存在碱基突变或缺失。