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第一部分人结直肠癌耐药细胞株的建立及特性目的:建立稳定的人结直肠癌耐奥沙利铂细胞株,并检测其部分特性,为后续实验打下基础。方法:(1)在两种人结直肠癌细胞株(SW480、SW620,称之为亲本细胞)的培养液中,通过逐渐提高化疗药物奥沙利铂(Oxa)的浓度,建立稳定的耐Oxa细胞株(SW480/OxR、SW620/OxR,称之为耐药细胞);(2)与亲本细胞比较,采用以下方法检测耐药细胞株的一些生物学特性:采用WST-1试剂检测两种细胞对化疗药物Oxa和5-FU的敏感性;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MDR-1、Survivin及Oct4mRNA表达水平;采用流式间接法检测耐药相关蛋白(P-gp和Survivin)表达情况;采用流式直接法检测肿瘤干细胞(CSCs)标记物CD44、CD133的表达情况;比较耐药细胞及亲本细胞接种NOD/SCID小鼠后成瘤能力的变化;采用Western blot方法检测上皮间质转化(EMT)标记物(E-ca、N-ca、Vim)及Oct4蛋白的变化。结果:细胞增殖试剂WST-1检测细胞增殖情况结果为:亲本细胞加药(Oxa及5-FU)72h后细胞数量明显减少(P<0.01),而耐药细胞加药后细胞数量变化不大(P>0.05);耐药细胞MDR-1、Survivin及Oct4mRNA表达水平较亲本细胞明显增高(P<0.01);耐药细胞中P-gp~+及Survivin~+细胞比例较亲本细胞明显增高(P<0.01);耐药细胞中CSCs标记物(CD133~+及CD44~+)表达比例明显增多;耐药细胞在NOD/SCID小鼠的致瘤性明显增强;SW620/OxR细胞相对于SW620细胞,间质标记物(N-ca及Vim)蛋白表达明显增高(P<0.05及P<0.01),而上皮标记物(E-ca)蛋白表达水平明显降低(P<0.01);耐药细胞Oct4mRNA及蛋白水平均明显高于亲本细胞(P <0.01)。结论:耐药细胞相对于亲本细胞具有以下特性:多药耐药特性;EMT特性(SW620/OxR细胞相对于SW620细胞);高表达CSCs标记物(CD133及CD44);NOD/SCID小鼠致瘤性增强;高表达转录因子Oct4;说明耐药细胞富集CSCs并高表达转录因子Oct4。第二部分Oct4-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定(外筛内验)目的:构建能够有效沉默Oct4基因的Oct4-shRNA慢病毒载体,在人结直肠癌SW480细胞验证其对Oct4的抑制效率及其对细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法:(1)构建针对Oct4的4个Oct4-shRNA干扰慢病毒载体质粒(干扰序列分别称为pSC-1、pSC-2、pSC-3、pSC-4),用Oct4与GFP融合的过表达质粒分别与4个干扰质粒共转染293T细胞(称之为外源筛靶实验),采用Western blot检测GFP的表达,筛选出干扰效果最好的Oct4-shRNA慢病毒载体,用293T细胞包装;(2)转染人结直肠癌SW480细胞的实验(称之为内源验证实验):实验分3组:①空白对照组(Con):不转染慢病毒,②阴性对照组(NC):转染阴性对照慢病毒,③RNA干扰组(RNAi):转染Oct4-shRNA慢病毒载体;对上述3组采用RT-qPCR检测Oct4-mRNA,Western blot检测Oct4、p-Akt蛋白,流式细胞仪测定Oct4~+、CD44~+细胞比例及肿瘤细胞凋亡情况。结果:(1)在293T细胞的外源筛靶实验结果提示,含pSC-2干扰序列的Oct4-shRNA慢病毒载体质粒干扰效果最好(GFP蛋白表达量明显减少);(2)在SW480细胞的内源验证结果提示,与Con组及NC组比较,RNAi组SW480细胞Oct4的mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.01),CD44~+细胞比例明显减少,p-Akt蛋白明显受抑制(P<0.01),细胞凋亡明显增加(P<0.01),而Con组与NC组比较,无统计学意义(P>0.05)。结论:我们成功构建了能够有效沉默Oct4基因的Oct4-shRNA慢病毒载体,用其沉默Oct4基因可明显减少SW480细胞中CD44~+细胞比例,增加细胞凋亡,其作用可能与PI3K/Akt通路有关。第三部分Oct4在富集肿瘤干细胞的结直肠癌耐药细胞中抗凋亡作用及机制研究目的:明确Oct4在富集CSCs的人结肠癌耐药细胞株中是否具有抗凋亡作用,并探讨其作用是否与STAT3/Survivin通路有关。方法:(1)采用Western blot方法比较STAT3、磷酸化STAT3(P-STAT3)及Survivin蛋白在耐药细胞及亲本细胞的表达情况;采用免疫荧光法检测Oct4与P-STAT3在耐药细胞中的共表达情况。(2)Oct4-shRNA慢病毒载体沉默耐药细胞(SW480/OxR和SW620/OxR)Oct4基因的实验:两种细胞均分以下2组:①阴性对照组(NC):转染阴性对照慢病毒,②RNA干扰组(RNAi):转染Oct4-shRNA慢病毒载体;对上述2组采用RT-qPCR检测Oct4、STAT3及Survivin-mRNA变化;Western blot检测Oct4、STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白的变化;采用流式直接法检测CSCs标记物CD44、CD133的变化;比较细胞接种NOD/SCID小鼠后成瘤能力的变化;采用流式细胞技术检测细胞凋亡的变化。结果:耐药细胞与亲本细胞比较,STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白表达明显增高(P<0.01或P<0.05);Oct4与P-STAT3(pY705)蛋白在耐药细胞及亲本细胞中均共表达于细胞核,耐药细胞表达较亲本细胞明显增强;Oct4-shRNA慢病毒载体沉默耐药细胞Oct4基因后,STAT3及Survivin-mRNA水平明显降低(P<0.01),STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白表达显著下降(P<0.01),肿瘤干细胞标记物CD44~+、CD133~+细胞比例明显下降,细胞凋亡明显增加,NOD/SCID小鼠致瘤性明显减弱,肿瘤生长明显受抑制(P<0.05)。结论:Oct4在富集肿瘤干细胞的人结肠癌耐药细胞株中具有抗凋亡作用,其作用可能与STAT3/Survivin通路有关。