续随子二酰甘油酰基转移酶基因(ElDGAT2)的克隆和功能研究

来源 :山西农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:javajava2010
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续随子(Euphorbia lathyris L.)是一种新型的且具有发展潜力的优良能源油料植物,种子中油脂积累达60%,其油分中有30%-40%的化合物类似于石油中的碳氢化合物,是制备生物柴油的优质原料,且油中的脂肪酸以C16和C18为主,尤其是单不饱和油酸含量高达83%。二酰甘油酰基转移酶2(Diacylglycerol Acyltransferase 2,DGAT2)催化二酰甘油(DAG)形成三酰甘油(TAG),是植物种子油脂合成的限速酶。迄今为止,已在大豆、紫苏、拟南芥等植物中克隆到DGAT2基因且进行了功能研究。然而,鲜有关于续随子种子油脂合成机制及El DGAT2基因的详尽研究,尽管这对特色油料植物续随子优质油脂产品开发及可持续发展尤为重要。为此,本研究从续随子发育种子中分离编码二酰甘油酰基转移酶2的c DNA克隆(El DGAT2),研究该基因在续随子不同器官组织的表达谱。构建El DGAT2的酵母表达载体和组成型植物表达载体,通过酵母互补功能试验和农杆菌介导烟草瞬时表达,并检测转基因酵母及烟草叶片的总脂含量与各脂肪酸组分含量,来分析El DGAT2基因的生物学功能。为深入解析续随子种子油脂合成及油酸高水平积累机制提供新知识,El DGAT2亦可用于植物油脂及其品质的基因工程改良。主要研究结果如下:1.基于续随子转录组数据库,鉴定得到续随子DGAT2基因(命名为El DGAT2)。表达分析结果发现,续随子El DGAT2基因在根、茎、叶、花及种子中均发生表达,在种子中的表达量显著高于其他器官,且在种子的发育中期(花后30 d),即油脂快速合成积累时期的表达量最高,其表达量约为叶组织的12.83倍。2.高保真RT-PCR从续随子发育种子中克隆到El DGAT2基因的c DNA,分析El DGAT2酶蛋白的理化性质、亚细胞定位、高级结构及系统发育等特性。续随子El DGAT2基因的c DNA全长为1939 bp,ORF为984 bp,编码327个氨基酸。二级结构主要结构元件为α-螺旋(37.00%)和无规则卷曲(34.25%)。多序列比对发现,El DGAT2蛋白具有7个典型的DGAT2酶蛋白家族的保守结构域。DGAT2蛋白进化树分析揭示,续随子El DGAT2与同科植物蓖麻、油桐、麻疯树的DGAT2蛋白亲缘关系较近。3.成功构建续随子El DGAT2基因的酵母表达载体p YES2.0-El DGAT2,将该基因成功转入到酵母中。对转基因酵母进行TLC分析和尼罗红染色,并分析其总脂含量与各脂肪酸组分含量。结果显示,在转基因的缺陷型酵母中检测到油体的存在,即El DGAT2基因使缺陷型酵母H1246恢复了TAG合成能力,表明El DGAT2基因编码蛋白具有DGAT活性。转El DGAT2基因的酵母总脂含量提高了8.65%,且棕榈酸(16:0)、油酸(18:1)的含量升高,表明该基因能提高总脂含量且可能对油酸有底物选择性。4.成功构建续随子El DGAT2基因组成型植物表达载体p CAMBIA1303-El DGAT2,并通过农杆菌介导的烟草瞬时表达研究El DGAT2基因的功能。对转基因烟草叶片进行RNA水平的鉴定,表明El DGAT2基因成功整合到烟草叶片中并有效表达。测定了瞬时表达烟叶的总脂含量、脂肪酸组分与含量、蛋白和淀粉含量,结果显示,El DGAT2瞬时表达的烟叶组织总油脂含量提高1.59%,饱和脂肪酸棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量减少,油酸(18:1)等不饱和脂肪酸含量增加,说明El DGAT2编码一个具有催化活性的DGAT2酶蛋白,异源表达可提高宿主组织总油脂和不饱和脂肪酸的合成积累,显示El DGAT2对油酸等不饱和脂肪酸有底物偏好性。而且在转基因烟叶中淀粉和蛋白含量均发生了下降。总之,本研究首次鉴定出续随子El DGAT2基因并克隆其c DNA,是续随子中继El DGAT1后第二个被证明具有DGAT活性的酶蛋白,能显著促进宿主组织的油脂积累。为解析续随子油脂合成分子机理以及油料作物油脂改良与开发利用提供科学参考。
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