褐鳟(Salmo trutta)原产于欧洲、北非和西亚地区,在我国仅分布于西藏亚东地区,由于过度捕捞和对生境的人为破坏,导致其野生资源急剧减少。LEAP-2(liver-expressed antimicrobial peptide-2)是一类主要在肝脏表达的抗菌肽,其具有较强的抗微生物活性,能够帮助机体抵抗外源微生物的入侵。本研究以褐鳟为研究对象,通过同源克隆的方法得到抗菌肽基因LEAP-2的ORF序列,并分析序列特征。利用荧光定量PCR技术检测其在褐鳟不同组织中的表达情况。构建褐鳟LEAP-2基因成熟肽的原核表达载体,通过大肠杆菌进行表达,优化表达条件,为进一步研究LEAP-2的功能奠定了基础。主要研究结果如下:1.褐鳟LEAP-2基因ORF序列全长291 bp,编码96个氨基酸,相对分子量为10.78 KDa,等电点为9.19,带有5个正电荷。多序列氨基酸对比分析显示,褐鳟LEAP-2由信号肽、前体肽和成熟肽三部分组成,在成熟肽上存在4个高度保守的半胱氨酸,可形成两对二硫键。氨基酸结构和功能位点分析显示,褐鳟LEAP-2存在4个糖基化位点和7个磷酸化位点,二级结构主要以α螺旋和无规则蜷曲为主,三级结构与人类LEAP-2相似。系统进化分析显示,褐鳟LEAP-2与其他硬骨鱼类具有较高的同源性,其中与大西洋鲑的亲缘关系最近,而与鸟类和哺乳类同源性较低,处于不同的分支上。2.荧光定量PCR结果显示,LEAP-2在褐鳟各组织中均有不同程度的表达,其中肝脏的表达量最高,其次是脾和肠,在肾、心脏、肌肉和鳃中的表达量较低,而在脑和皮肤中几乎不表达。3.成功构建pET32a-mLEAP-2原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到原核表达菌株,分析重组蛋白可溶性,对IPTG诱导浓度和诱导时间进行优化,纯化重组蛋白。在pET32a-mLEAP-2重组表达体系中,重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于上清液中,少量以包涵体形式存在于沉淀中,分子量为22.61 KDa。改变IPTG诱导浓度和诱导时间,发现通过0.25 mmol/L IPTG诱导4 h后,重组蛋白的表达量最高。