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生猪产业是我国国民经济的支柱产业。对仔猪实施早期断奶是现代养猪生产中的关键技术之一,该措施可提高母猪繁殖效率和分娩舍利用率,还有利于疾病防控等。然而早期断奶应激会影响仔猪肠道黏膜屏障发育和微生态环境,导致食欲下降、消化不良,进一步引发腹泻甚至死亡。断奶后腹泻一直是困扰养猪业的重大难题之一。因此深入研究早期断奶腹泻仔猪肠道功能的变化,寻找预防和缓解断奶仔猪腹泻的潜在靶点,是寻求营养干预缓解仔猪腹泻的重要突破口。覆盖于肠道表面的黏液屏障能够避免细菌与肠上皮的直接接触,保护组织免受损伤和菌群易位,是机体防御的第一道防线。O-糖基化的黏蛋白构成了黏液层的骨架结构,O-型糖链可作为宿主-病原菌互作的信号分子,为肠道微生物提供能量,还能抵抗蛋白酶的过度降解,有效地增强肠道屏障功能。然而目前针对断奶仔猪肠道黏液屏障的特征研究尚不够深入,那么腹泻断奶仔猪肠道黏液屏障发生了哪些变化?又是否与肠道菌群组成有关联?这些变化如何影响肠道黏膜屏障功能等问题都需要研究探明。基于此,本研究从规模化生产猪场同窝中选取腹泻和健康断奶仔猪,基于糖组学、微生物组学、靶向代谢组学,结合体外发酵和细胞培养技术,并借助相关性网络分析系统解析黏蛋白O-型糖在腹泻仔猪肠道中的变化特征,探讨其在仔猪肠道黏膜屏障中的作用机制。本研究旨在为探寻预防和缓解仔猪腹泻的靶点提供科学依据。本研究主要结果如下:试验1腹泻与健康断奶仔猪肠道黏蛋白O-型糖结构和丰度的差异研究本试验连续7天观察6窝21日龄早期断奶的仔猪,在28日龄时,从中选取8头腹泻仔猪,以同窝、初始体重接近及性别一致的健康仔猪作为对照。对16头仔猪称重采血后进行屠宰,剖开腹腔后分离出结肠,横向剪取仔猪的结肠组织约0.5 cm固定于卡诺氏固定液中,用于肠道杯状细胞和黏液层厚度的观察和定量,刮取结肠黏膜放置于加有蛋白酶抑制剂的冻存管中保存,用于黏蛋白O-型糖的检测。结果表明,腹泻断奶仔猪体重有降低的趋势,而肝脏和脾脏校正重量显著增加;腹泻仔猪黏液层形态受损,厚度显著低于健康仔猪,杯状细胞数量和黏液相关基因MUC2、MUC4和RETNLB表达量均显著降低;PGC-LC-MS/MS结果表明在仔猪结肠共鉴定出57个O-型糖结构,PLS-DA分析发现腹泻与健康断奶仔猪黏蛋白O-型糖群体明显分开;在O-型糖的Core结构中,Core 2和Core 4的相对丰度高于Core 1和Core 3,是主要的核心结构,Core4结构的相对丰度最高,而Core 2是肠道中数量最多的O-型糖结构;对黏蛋白末端糖的变化统计发现,腹泻仔猪结肠中中性糖的相对丰度增加,而酸性糖的相对丰度显著降低,同时其对应的糖基转移酶表达量也显著降低;在仔猪结肠中O-糖链由2-6个单糖组成,统计分析发现腹泻仔猪结肠短链O-型糖丰度显著增加,而长链O-型糖相对丰度显著降低,同时负责延长糖链丰度的糖基转移酶的基因表达量也显著降低。综上表明,腹泻断奶仔猪肠道黏液层受损,同时黏蛋白O-型糖异常。试验2腹泻断奶仔猪肠道微生物及其代谢产物的变化收集试验1仔猪回肠黏膜、结肠黏膜和内容物及粪便用于微生物组成和代谢物的测定。16S r RNA基因高通量测序结果表明两组仔猪回肠黏膜α多样性指数无显著差异;PCo A分析发现腹泻与健康断奶仔猪回肠黏膜微生物群体有分离的趋势,而结肠黏膜和内容物微生物群体有明显差异;进一步使用LEf Se的分析方法寻找肠道的菌群标记物,回肠黏膜中改变的细菌主要集中在属水平,腹泻仔猪回肠中Dorea和Holdemanella相对丰度增加,而Roseburia、Propionicicella和Atopostipes等菌的相对丰度下降;在结肠黏膜中,腹泻仔猪Peptococcus、Campylobacter和Peptostreptococcus的相对丰度显著升高,而一些属于Firmicutes门水平的Phascolarctobacterium、Lachnospiraceae FCS020 group和Eubacterium hallii group菌属相对丰度降低。在结肠内容物中,腹泻仔猪肠道富集了高丰度的Escherichia Shigella、Anaerobiospirillum、Peptostreptococcus和Alloprevotella,同时一些属于Proteobacteria门水平的Gammaproteobacteria、Enterobacteriaceae和Enterobacterales相对丰度也显著上升;对代谢产物检测发现腹泻仔猪结肠内容物和粪便中丁酸含量显著降低,而结肠中乳酸含量显著增加;LC-MS/MS结果表明腹泻仔猪粪便中次级胆汁酸（SBA）含量显著降低,进一步分析发现石胆酸（LCA）和猪脱氧胆酸（HDCA）浓度显著降低;以上结果表明腹泻仔猪肠道微生物群紊乱,且主要发生在结肠部位,同时次级胆汁酸含量的降低进一步证明紊乱的微生物群落不能有效地进行分解代谢活动,致使代谢物异常。试验3腹泻与健康断奶仔猪肠道黏膜屏障特征比较研究收集试验1仔猪的回肠和结肠,剪取约0.5 cm的肠环固定于4%多聚甲醛中,用于形态学观察,刮取黏膜用于总RNA和蛋白的提取。结果发现:腹泻仔猪血清二胺氧化酶活性和LPS浓度显著升高,回肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度显著降低,结肠隐窝深度显著增加;Western blot结果显示腹泻仔猪回肠和结肠ZO-1和Occludin蛋白表达显著降低,结肠Claudin1蛋白表达也显著降低,q RT-PCR结果表明回肠和结肠ZO-1、Occludin、Claudin2和Claudin4基因表达量也降低;RT-PCR结果也证实腹泻仔猪肠道病原菌易位,肝脏和结肠中E.coli含量显著增加,脾脏中有增加的趋势;ELISA结果表明腹泻仔猪血清促炎性细胞因子IL-6和IL-8显著增加,同时结肠黏膜IL-6、IL-8和TNF-a含量显著升高,而回肠黏膜中细胞因子的表达无显著差异。上述结果表明腹泻仔猪回肠和结肠上皮屏障受损,表现为紧密连接蛋白表达降低,肠道通透性增加。此外,腹泻仔猪还表现出系统性炎症反应,且与回肠相比,结肠部位炎症反应更为严重。试验4黏蛋白O-型糖调控肠道稳态的作用机制研究在前期发现腹泻仔猪肠道黏蛋白O-型糖异常的基础上,本试验旨在进一步探究黏蛋白O-型糖调控肠道稳态的机制。按照试验3中操作方法收集两组仔猪结肠黏蛋白O-型糖,另外选取并收集8头28日龄的健康仔猪的粪便,以黏蛋白O-型糖作为底物,粪便混合物作为接种物进行体外发酵,24h后收集上清和沉淀用于短链脂肪酸和微生物的测定。结果发现以腹泻仔猪黏蛋白O-型糖为底物显著降低了六种短链脂肪酸的浓度;16S r RNA基因高通量测序结果表明接种腹泻和健康仔猪结肠黏蛋白O-型糖的微生物区系的a和b多样性有显著差异;LEf Se分析表明在门水平,腹泻仔猪黏蛋白O-型糖显著增加了Desulfobacterota的相对丰度,而降低了Fusobacteriota的相对丰度。在属水平,接种腹泻仔猪黏蛋白O-型糖后富集了Desulfovibrio和Lactobacillus,而Prevotella、Ruminococcus torques group和Faecalibacterium的相对丰度显著降低,同时,腹泻仔猪黏蛋白O-型糖底物还降低了Blautia和Subdoligranulum的相对丰度,降低了Parabacteroides、Phascolarctobacterium和Bacteroides的相对丰度;在此基础上,为进一步明确O-型糖在细菌侵袭肠道上皮中的作用,使用抑制剂抑制T84细胞的O-糖链合成,结果发现,抑制O-糖基化后,黏附于细胞的E.coli k88数量减少,同时黏蛋白相关基因表达显著降低,屏障功能相关基因如IL-18、IL-6、IL-8和ZO-1的表达也显著降低;表明仔猪肠道黏蛋白O-型糖与微生物相互调节以维持肠道稳态后,进一步探究与黏蛋白相关的下游信号通路,发现在腹泻仔猪结肠中炎性小体NLRP3、ASC和Caspase1的表达显著增加,并促进了IL-1b和IL-18的释放;同时,自噬蛋白ATG7、ATG5和LC3A/B II的表达降低,而自噬小体底物p62在腹泻仔猪结肠中积累。在体外细胞试验中进一步评估发现E.coli k88感染T84细胞后,自噬基因ATG5、ATG7和LC3B的表达显著降低,而自噬体底物p62的表达显著增加。为了建立黏蛋白与自噬过程的联系,使用3-MA抑制T84细胞的自噬过程,结果发现E.coli k88感染会显著降低黏液相关基因MUC2、MUC17、MUC5AC、TFF3、RETNLB、FCGBP和ATF4的表达。以上结果表明,在腹泻仔猪中自噬-炎性小体可能是黏液分泌缺陷和O-型糖异常的信号通路,从而影响仔猪肠道微生态环境。综上所述,腹泻仔猪肠道炎性小体过度激活而自噬过程受到抑制,这可能介导了黏液分泌缺陷和异常的黏蛋白O-型糖,包括黏液层形态的丧失、O-糖链长度变短和酸性末端糖丰度降低,进一步导致了肠道菌群失调、上皮和免疫屏障功能受损。本研究探讨了黏蛋白O-型糖维持肠道稳态的作用机制,为预防和缓解仔猪腹泻提供新的理论基础和科学依据。