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含硫燃料的燃烧造成环境污染和健康危害,因此全球社会都逐步开发超低硫或无硫燃料油。生物脱硫的4S途径可以特异性地裂解二苯并噻吩（DBT）的C-S键,同时保持其碳骨架和燃烧值完整,该优势使生物脱硫的4S途径成为一种低成本且环保的技术,可用作主流加氢脱硫法的补充策略。生物脱硫目前尚未实现达到工业应用的目标,其中各Dsz酶所受的抑制作用是4S途径的主要瓶颈之一。DszC是脱硫的关键起始酶,在所有Dsz酶中,DszC受到来自2-羟基苯酚（HBP）的反馈抑制作用最为严重。同时它也被DBT和2-羟基联苯-2-亚磺酸（HBPS）抑制,这严重地限制了4S途径的脱硫效率。本研究旨在通过蛋白质工程减轻DszC的反馈抑制和底物抑制,并基于动力学建模结果过表达DszC以提高重组大肠杆菌菌株中4S途径的脱硫速率。具体研究结果如下:（1）4S途径在大肠杆菌中的重构以及Dsz酶表达量的调节通过将来源于R.erythropolis IGTS8的dszABCD基因进行密码子优化后克隆至大肠杆菌,并优化dsz表达盒。根据已报道的Dsz酶动力学参数建立了反应动力学模型,预测结果为当DszC和DszB浓度高时可提高HBP的生成速率。不同比例的已纯化Dsz酶与BADC细胞提取液组合进行体外脱硫,当BADC+1A+4B+2C时转化率接近100%,比仅有BADC细胞提取物的转化率提高约9倍。将dsz基因单独或组合加入含有pSB4A5-BADC的BL21（DE3）感受态中,BL21（DE3）/BADC+C菌株的HBP产量比BL21（DE3）/BADC菌株提高约6倍,其特异性脱硫速率达到98.05μMHBP/gDCW/h,是目前已报道最高值的4.3倍。（2）DszC反馈抑制脱敏突变体高通量筛选方法的建立及突变体催化效率的评价通过易错PCR建立DszC突变文库,并建立了基于静息细胞模块和显色反应模块的高通量筛选方法。经筛选得到A101V菌株的HBP产量比野生型菌株提高27.60%。突变体A101V在提高酶活力、解除反馈抑制、解除底物抑制方面均有贡献。通过Discovery Studio计算机中的小分子配体模拟对接发现A101V所在的结合口袋中W327与HBP形成π键,其成为潜在的关键氨基酸。（3）DszC分子迭代饱和突变对反馈抑制的脱敏通过对第101位氨基酸定点饱和突变,发现A101K突变体的酶活力最高,比野生型DszC的酶活力提高57.51%。在A101K基础上对第327位氨基酸进行饱和突变,AKWC和AKWY突变体酶活力分别比野生型DszC提高约3.3和2.6倍,且它们的IC50值分别从3.95±0.24μM增加至80.38±2.52 mM和83.00±1.12 mM,说明第327位氨基酸的突变对DszC的反馈抑制脱敏至关重要。AKWC的底物抑制作用降低。携带AKWC突变体的重组菌株HBP产量比野生型菌株提高4.4倍。AKWC过表达的重组菌株BL21（DE3）/BADC*+C*（C*代表AKWC）HBP的产量比野生型菌株提高了23.6倍,特异性转化率达到214.84μmolHBP/gDCW/h,为目前报道最高值,距BDS商业应用要求的1-3 mmolHBP/gDCW/h目标更近了一步。（4）丙氨酸扫描和定点饱和突变对DszC底物抑制的减轻通过在AKWC的基础上构建40个位于二聚面的丙氨酸突变体,分别替换至BL21（DE3）/BADC中,通过筛选得到当DBT浓度为0.25和0.5 mM时,BL21（DE3）/BAD（AKWCP413A）菌株HBP产量比BL21（DE3）/BAD（AKWC）菌株分别提高56.81%和39.88%。将第413位氨基酸在AKWC基础上定点饱和突变,AKWCPI突变体在1 mM DBT浓度条件下仍能保持最大酶活力的57%。AKWCPI保留了大部分抵抗HBP反馈抑制的优势,且其对高浓度DBT有更高的耐受能力,最大酶活力达到27.27U/mg,比AKWC提高约43%,而单点突变体P413I几乎没有酶活力。当DBT浓度为0.25 mM时,BL21（DE3）/BADC**+C**菌所获得的HBP产量比BL21（DE3）/BADC*+C*提高39.89%。对反馈抑制和底物抑制的脱敏工程结合脱敏DszC蛋白过表达的策略克服了4S途径中DszC酶的抑制瓶颈,这是生产无硫燃料油过程中的有效进展。同时本研究的结果也为优化改造存在反馈抑制和底物抑制的代谢途径提供了有效策略和成功案例。