中药及其多糖成分具有广泛的生物活性,尤其是增强免疫和抗病毒活性,显示了广阔的药用前景。硫酸多糖是一类糖羟基上带有硫酸根的多糖,比天然多糖具有更多、更强的生物活性,完全可以开发为新型免疫增强剂。本研究在以前研究的基础上,以黄芪多糖、硫酸化黄芪多糖、淫羊藿多糖、硫酸化淫羊藿多糖、黄芪提取物组成5个复方,通过体内外试验比较筛选出1个增强免疫作用较好的复方,命名为芪藿糖增免剂(AEI),并对其制备工艺、质量控制、安全性、临床药效和作用机理进行了系列研究。研究主要包括以下七个部分：试验Ⅰ.中药多糖复方免疫增强剂的处方筛选分别以硫酸化黄芪多糖加硫酸化淫羊藿多糖(sAPS-sEPS)、硫酸化黄芪多糖加淫羊藿多糖(sAPS-EPS)、黄芪多糖加硫酸化淫羊藿多糖(APS-sEPS)、黄芪多糖加淫羊藿多糖(APS-EPS)、黄芪提取物加硫酸化淫羊藿多糖(AE-sEPS)组成5个复方,体外试验,用MTT法比较前4个复方对鸡外周血T淋巴细胞增殖的影响；体内试验,比较了前4个复方对新城疫苗免疫雏鸡血清抗体效价的影响,筛选出效果最好的APS-sEPS。剂量筛选试验,比较了APS-sEPS 7种剂量的增强免疫作用。取14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡450羽随机均分为9组,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、点眼免疫,28日龄二免。在首次免疫同时,7个药物剂量组分别每羽注射12、10、8、6、4、2、0.5 mg的APS-sEPS 0.5 mL,无佐剂对照组和空白对照组注射等量生理盐水。分别于首免后第7、14、21和28d采血,测定外周血T淋巴细胞增殖和血清抗体效价。结果显示,6 mg/羽时作用最佳。复方优化试验,比较了APS-sEPS和AE-sEPS体外对T淋巴细胞的增殖、体内对新城疫苗免疫雏鸡血清抗体效价的影响,结果显示,AE-sEPS的效果稍优于APS-sEPS。因此,最终确定方剂的组成为黄芪提取物加硫酸化淫羊藿多糖,命名为芪藿糖增免剂(AEI)。试验Ⅱ.AEI制备工艺的研究研究了黄芪提取物和淫羊藿多糖的提取条件。黄芪提取物提取试验,以黄芪提取物中黄芪多糖和黄芪甲苷的得率为指标,对提取次数(A)、每次煮沸时间(B)和加水倍数(C)进行3因素、3水平正交实验。结果表明,各因素对多糖提取率的影响大小依次为A>C>B,对黄芪甲苷得率的影响大小依次为C>A>B,综合两个指标,结合生产成本考虑,确定黄芪提取物最佳提取工艺为提取3次,每次加10倍水、煮沸1 h。淫羊藿多糖提取试验,以淫羊藿多糖的提取率和糖含量为指标,对3次煎煮时间和加水倍数进行4因素、3水平正交实验。结果显示,各因素对淫羊藿多糖提取率的影响大小依次D>B>C>A,对糖含量的影响大小依次D>B>A>C,加水倍数对两个指标的影响最大,综合考虑,确定淫羊藿多糖最佳提取条件为提取2次,每次加20倍水,第一次煮沸1.5 h,第二次煮沸1 h。根据以上试验结果,确定了AEI的制备工艺。试验Ⅲ.AEI质量控制的研究研究了AEI的鉴别和含量测定。黄芪甲苷鉴别试验,比较4种取样量和5种展开剂的薄层色谱效果。结果显示,取样量在15 mL以上、展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸(25：40：15：5：0.5)时,色谱斑点比较清晰,分离度好,建立的色谱方法和条件可行。多糖含量测定试验,建立了苯酚-硫酸法,并对方法进行了考察。结果显示,样品在490 nm波长处有葡萄糖最大吸收峰,多糖含量在0.01～0.5 mg·mL-1范围内线性关系良好,精密度较高,供试液在3h内稳定,重现性较好,可用于AEI多糖含量的测定。黄芪甲苷的含量试验,建立了HPLC-ELSD法,并对方法进行了考察。结果显示,黄芪甲苷含量在0.04～1 mg·mL-1范围内线性关系良好,精密度较高,供试品溶液在12h内稳定,重现性较好。硫酸根含量测定试验,建立了铬酸钡分光光度法,并对方法进行了考察。结果显示,样品在375 nm波长处有最大吸收峰,硫酸根浓度在0.01～0.05 mg·mL-1范围内线性关系良好,精密度和回收率较高,供试品溶液在3h内稳定,方法可行。试验Ⅳ.AEI的安全性研究按照兽药试验技术规范规定的方法测定了AEI的急性毒性、长期毒性、肌肉刺激性、溶血性和致敏性。急性毒性结果显示,AEI的LD50为0.59 g·kg-1,LD50的95%可信限范围为0.542 g·kg-1～0.642 g·kg-1,相当于雏鸡临床用量的10倍以上。长期毒性试验给药期间,高剂量组小鼠体重减轻,红细胞总数和血红蛋白含量显著降低,中、低剂量组小鼠平均增重低于对照组,中剂量组的谷丙转氨酶、各给药组的碱性磷酸酶显著低于对照组；但至停药后14d,各给药组的平均增重、脏器指数均高于或显著高于对照组,血常规和血清酶与对照组无显著差异,组织学观察未见明显的病理变化。肌肉刺激性,家兔股四头肌注射的反应级数2级以下,鸡按临床剂量腿肌注射后无明显反应。过敏性和溶血性,呈阴性反应。以上结果表明,AEI应用安全。试验Ⅴ.AEI对鸡新城疫苗和禽流感疫苗免疫效果的影响新城疫免疫试验,14日龄非免疫雏鸡300羽随机均分为6组,每组50羽,除空白对照组外,均用新城疫疫苗滴鼻、点眼免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,高、中、低剂量的药物试验组分别肌肉注射AEI 0.75、0.5、0.25 mL,药物对照组肌肉注射黄芪多糖注射液0.3 mL,无佐剂对照组和空白对照组注射生理盐水0.5mL。分别于首次免疫后第7、14、21、28 d,每组随机抽取6羽翼静脉采血,分离血清,用p-微量法检测抗体效价；每组随机抽取4羽,心脏采血,肝素抗凝,用MTT法检测淋巴细胞增殖(A570值)。禽流感免疫试验,以禽流感疫苗用灭活抗原、AEI、油佐剂材料和注射用水分别制成每羽份含等量抗原的含高、中、低浓度AEI的佐剂疫苗、油佐剂疫苗和无佐剂疫苗,17日龄非免疫雏鸡300羽随机均分为6组,AEI的高、中、低剂量组分别皮下注射含高、中、低浓度AEI的疫苗,油佐剂对照组和无佐剂对照组分别注射油佐剂疫苗、无佐剂疫苗,空白对照组注射生理盐水,28日龄二免。采样时间测定指标同上。结果表明,AEI能显著提高血清抗体效价,促进淋巴细胞增殖。增强ND疫苗的效果稍优于黄芪多糖,增强AI疫苗的效果稍优于油佐剂。试验Ⅵ.AEI拮抗免疫抑制的作用11日龄非免疫雏鸡300羽随机均分为6组,分别为药物高、中、低剂量组、药物对照组、模型对照组、免疫对照组。除免疫对照组外均肌肉注射8 mg·mL-1的环磷酰胺溶液0.5 mL,连续3天；14日龄时,各组均用新城疫疫苗滴鼻、点眼免疫；药物高、中、低剂量组分别肌肉注射AEI 0.75、0.5、0.25 mL,药物对照组肌肉注射黄芪多糖注射液0.3 mL,模型对照组和免疫对照组注射生理盐水0.5 mL,每天1次,连续3 d。分别于首次给药后第7、14、21和28 d,每组随机抽取6羽翅静脉采血,分离血清,p-微量法检测抗体效价,ELISA法测定IFN-γ、IL-2、IgG、IgM的含量。结果表明,AEI单独应用能显著拮抗环磷酰胺诱导的免疫抑制、提高ND-HI抗体效价水平、诱导IFN-γ、IL-2、IgG、IGM的分泌,增强免疫功能。试验Ⅶ.AEI体外对鸡淋巴细胞增殖及相关细胞因子mRNA表达的调节作用淋巴细胞增殖试验,首先用MTT法测定AEI对淋巴细胞的安全浓度,再取安全浓度范围内5个浓度的AEI单独或与PHA同时加入到体外培养的鸡外周血淋巴细胞中,同法测定T淋巴细胞增殖的变化。结果显示,AEI对鸡淋巴细胞的最大安全浓度为18.75μg·mL-1,在5～0.625μg·mL-1范围内AEI能显著刺激淋巴细胞增殖。细胞因子mRNA表达试验,用Primer Premier软件分别设计了IL-2、IL一4、IFN-γ和β-action 4对引物。将3种浓度的AEI、APS、sEPS加入鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,36h后收集细胞,提取总RNA,用实时荧光定量PCR方法测定细胞因子mRNA的表达。结果表明,在7.5μg·mL-1和3.75μg·mL-1时,AEI对3种细胞因子的诱生作用显著强于APS和sEPS。