论文部分内容阅读
RNA病毒反向遗传学的发展极大地推动了RNA病毒的分子生物学研究和新型疫苗的开发。dsRNA病毒宿主范围广泛,对人或动物造成了重大危害和经济损失。但其反向遗传学的发展则远远落后于正链或负链RNA病毒。本研究以双RNA病毒科的传染性法氏囊病病毒(IBDV)为模式病毒,就dsRNA病毒的反向遗传进行探索性研究。首先克隆了IBDV ZJ2000株基因组B节段全长cDNA,ZJ2000株基因组B节段全长为2827bp,在GenBank登录号为DQ166818。ZJ2000株和TL2004株的体内、体外生物实验表明ZJ2000和TL2004株原代病毒均能直接适应CEF细胞,并引起明显的细胞病变,ZJ2000株在CEF细胞上的复制速度明显慢于弱毒株JDl株和HZ2株,TL2004株对9-11胚龄的SPF鸡胚和SPF鸡均有较强的致病性。对GenBank数据库中双RNA病毒进行生物信息学分析,在国内外首次发现双RNA病毒科中IBDV和IPNV各自的基因组重配现象,并在国内外首次提出双RNA病毒基因组重配模型。IBDV基因组重配毒株说明IBDV的毒力除VP2外,多重因素可以影响IBDV的毒力,尤其是B节段在决定毒力方面扮演着重要角色。以IBDV为模型,应用重叠PCR法在IBDV基因组A、B两节段的5’末端和3’末端分别引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,分别克隆到PCI真核表达载体当中,构建真核载体PCI-ma和PCI-mb,建立并联式共转染的IBDV反向遗传系统,成功实现了以IBDV HZ2株为母毒的IBDV的遗传拯救。继而应用红色和绿色报告基因构建串连式表达载体,该载体含两个独立的转录单位,结果显示报告基因串连式载体在同一靶细胞内的共表达情况明显优于两报告基因共转染在同一细胞内的表达效率。将IBDV基因组A、B节段以串连的方式构建到同一载体当中,该载体含两个独立的转录单位,载体命名为PCI-mab。将PCI-mab转染细胞进行病毒拯救,其拯救效率比并联式拯救效率提高100倍。以IBDV为模型,应用PCR法在IBDV基因组A、B两节段的5’末端和3’末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,构建T7启动子控制下的IBDV感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3预先感染1h的Vero细胞,建立了基于辅助病毒表达T7 RNA聚合酶的IBDV反向遗传系统,成功实现了以IBDV HZ2株为母毒的IBDV的遗传拯救。以IBDV为模型,成功实现了不依赖辅助病毒、借助表达T7 RNA聚合酶的细胞系的dsRNA病毒的遗传拯救。分别从原核表达菌株BL21工程菌基因组和痘病毒VTF7-3基因组中克隆T7 RNA聚合酶基因,结果显示克隆的基因同源性为100%。将T7 RNA聚合酶基因构建到逆转录病毒载体pLPCX中,经包装细胞PT67包装后得到具有感染性而不具有自我复制功能的假病毒颗粒JVT7,再将假病毒颗粒JVT7感染Vero细胞,经嘌呤霉素筛杀,建立了表达T7 RNA聚合酶的细胞系V-T7,并用此细胞系实现了IBDV的遗传拯救。