应用单克隆抗体-ELISA法检测啤酒中泡沫活性Z4蛋白质的研究

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本论文研究了啤酒泡沫活性蛋白质(Foam-positive protein)的一种关键组分Z4蛋白质的最佳提取条件,及通过免疫印迹(Western Blot)和质谱分析(Mass spectrum)对Z4蛋白质进行鉴定。并利用Z4蛋白免疫BALB/C小鼠,成功研制出2株Z4蛋白单克隆抗体,及建立了间接ELISA筛选方法,并在检测抗原方面得到初步应用。具体内容如下:本实验首先通过40%饱和(NH42SO4沉淀杂蛋白,再利用70%饱和(NH42SO4沉淀Z4蛋白;透析过夜,用50mmol·L-1 pH8.0 Pbs缓冲液预平衡后的阴离子层析柱(DEAE Sephadex A-50)进行分离,最后用50mmol·L-1 pH7.5的Tris缓冲液预平衡后的凝胶层析柱(Sephadex G-75)进行分离的方法,提取出高纯度泡沫活性Z4蛋白。利用Z4蛋白质与等量的佐剂(第一次完全佐剂,第二次不完全佐剂)充分乳化后采用腹腔和皮下免疫BALB/C小鼠(200μg/只),采用间接ELISA法进行筛选克隆,通过反复克隆筛选,最终成功地筛选出2株分泌特异性抗体的单克隆细胞株,分别命名为A4D2、A6H8。对2株单抗的特性鉴定结果为,腹水效价为106(A4D2)、105(A6H8),纯化后浓度为1.5mg·mL-1。A4D2和A6H8具有不同的抗原识别表位。免疫印记结果显示2单抗均具有较好的反应特异性,与浑浊蛋白、LTP1和Z7无交叉反应。最后利用ELISA方法的检测啤酒中的泡沫活性蛋白质,确定抗体包被的最佳工作浓度为1.17μg·mL-1(1:1280),孵抗原的最佳工作浓度为0.5μg·mL-1(1:400)。多抗IgG按1:1000稀释时效果最好。通过双抗体加心法(DS-ELISA)检测结果表明,Z4蛋白的抗体A4D2能检测出啤酒泡沫活性蛋白质Z4的最低浓度为1.875μg·mL-1。所建立的方法用于检测啤酒中泡沫Z4蛋白具有较高的特异性,重复性和稳定性。
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