4-羟基异亮氨酸（4-HIL）是一种很有前途的治疗糖尿病的药物。在我们之前的研究中,通过表达L-异亮氨酸（Ile）双加氧酶基因,在谷氨酸棒杆菌SN02中用自产的Ile合成出4-HIL。本研究针对谷氨酸棒杆菌中4-HIL合成的副产物——L-赖氨酸（Lys）,对该支路途径进行改造和进化,一方面敲除Lys输出蛋白编码基因lysE,阻断Lys向胞外运输,以减弱Lys的合成,提高4-HIL产量;另一方面构建并利用Lys感应性进化控制系统来驱动菌株发生程序性进化,以快速筛选得到4-HIL产量增加或Lys产量降低的正向突变菌株。主要研究内容和结果如下:1、为了降低Lys的积累,在SN02中敲除lysE,构建菌株SY01,在SY01中再敲除ddh,获得菌株SY02。SY01的Lys产量相比SN02大幅下降了80.0%,但是4-HIL产量也降低了37.1%。SY02的4-HIL产量为60.87±4.25 m M,与对照菌株SN02相比下降了38.9%;而Lys产量与SY01相当。为了增强Ile的供应,在SY01中表达lys C,所得菌株SY03的Ile浓度提升,但是Ile向4-HIL的转化率降低,使得4-HIL产量降低了57.2%,Lys产量也降低了40.3%。因此敲除lysE和ddh可以降低Lys的产量,但同时导致4-HIL产量降低。2、利用Lys生物传感器LysG-PlysE驱动荧光报告基因egfp和增变基因cdd的表达,构建Lys感应性进化控制系统表达质粒p MK,并将其导入4-HIL重组菌SZ06中得到程序性进化控制菌株SZ06/p MK。表征该菌株中的生物传感器对Lys的响应浓度和调控范围。当Lys浓度为5-30 m M时,该传感器对egfp表达的激活倍数为1.09-1.37倍。因此LysG-PlysE生物传感器能感知并根据Lys浓度激活下游靶基因的表达,它对Lys的灵敏度较高,但对下游基因的激活倍数较低。3、对进化控制菌株SZ06/p MK进行数轮连续进化,期间监测菌液的荧光变化,在荧光降低后随机挑选几十株突变菌株。根据4-HIL产量,八轮进化后（16天）随机筛选菌的正向突变率达到95.5%,4-HIL最高产量为63.98 m M;为了缩短进化时间,重新对出发菌SZ06/p MK进行了三轮进化（6天）,菌株的正突变率达到54.5%,4-HIL最高产量为70.67 m M。因此该Lys感应性进化控制系统能够通过感知Lys浓度,对重组菌的进化过程进行编程化控制,促进4-HIL的合成,同时能在更短的时间内获得正向突变菌株。4、从进化产生的几十株正突变菌中选取4-HIL产量最高的9株菌MK1-MK9进行摇瓶发酵。这9株菌的生长和葡萄糖消耗与对照菌株SZ06相似,4-HIL产量增加到92.72-146.29 m M,最高增加了89.5%。然而,这九株菌的副产物Lys含量（21.14-33.70m M）也有所增加。去除MK1-MK9中的进化控制质粒p MK,得到遗传稳定的突变菌株K1-K9并对它们进行摇瓶发酵。K1-K9的生长和葡萄糖消耗与对照菌株SZ06相似,4-HIL产量增加了10.6-28.4%,其中K3的产量最高,为152.19±14.60 m M。但是K1-K9的Lys浓度也略有增加。因此,利用这种Lys传感器驱动的编程化进化可以快速筛选到4-HIL产量显著提高的突变菌株。5、对K1-K9进行基因组重测序,确定这9株菌的共同突变位点。结合RT-PCR分析,发现dap C的-111T插入突变使其转录水平发生上调,这可能会导致Lys积累;而CGB98＿RS08395的T-476C点突变导致其转录上调,这可能会影响肽聚糖和细胞壁的合成。