目的：研究新鲜骨肉瘤组织深低温冷冻后的肿瘤细胞组织形态学改变及死亡机制，以探讨冷冻杀伤骨肉瘤细胞的有效时间及方式，为临床开展冷冻外科治疗提供依据。方法：(1)分组：将手术切取下的新鲜骨肉瘤标本即刻分为三组，即A组(对照组，未做任何处理)、B组(冷冻组)和C组(冻融组)。(2)实验过程：B组和C组标本各4份，大小一致，分别置于金属容器中以液氮浸泡5min、10min、15min、20min，并快速复温；其中C组各标本再复冻5min、10min、15min、20min后再次快速复温(即两次冻融)，各组标本固定备用。(3)采用光镜、透射电镜和流式细胞仪观察并检测A、B、C组骨肉瘤细胞冻融前后的形态学变化和变性坏死率、细胞凋亡率。结果：(1)A组为骨肉瘤组织，光镜下观察并分型：其中成骨细胞型5例，成软骨型3例，成纤维细胞型1例，毛细血管扩张型1例。透射电镜对其观察发现细胞异型性明显，细胞核常偏位，核膜凹陷，常见不规则的核仁和假包涵体。胞质丰富，含大量粗面内质网(RER)，并常扩张成多种形态的囊泡。(2)B组和C组标本经光镜下发现冷冻后冰晶造成空白区位于肿瘤细胞胞浆内外，可见到细胞变性坏死：细胞膜破裂，细胞内空化，胞浆溶解；同时有部分骨肉瘤细胞体积缩小，呈现凋亡改变：细胞膜完整，胞质致密、嗜酸性染色增强，核固缩、核碎裂并可形成凋亡小体，其常以分散单个形式存在，与周围细胞分离，不引起炎症反应。计算B组及C组肿瘤细胞变性坏死率为42％～61％，且B、C各组之间坏死率比较无统计学差异。(3)B组和C组标本经透射电镜对其超微结构观察发现冷冻区骨肉瘤细胞以坏死为主，表现为细胞膜溶解消失，粗面内质网肿胀，核糖体消失；坏死细胞周围可见肿瘤细胞凋亡的现象，表现为细胞体积缩小，核固缩并现成凋亡小体。与B组比较而言，C组肿瘤细胞的损伤程度进一步加重，甚至出现广泛性的细胞结构完全崩解消失，残余部分的细胞轮廓。(4)流式细胞仪检测显示B、C组标本较A组标本凋亡比例显著升高，B组及C组骨肉瘤细胞凋亡率为21％～48％，且B、C各组之间比较无统计学差异。结论：(1)深低温液氮冷冻不仅导致骨肉瘤细胞变性坏死，同时还诱导肿瘤细胞凋亡，这两种主要的灭活效应均导致骨肉瘤细胞不可逆死亡；(2)单次5分钟冻融即可达到灭活的效果；两次冻融对部分肿瘤细胞结构破坏的程度更严重，但较单次冻融肿瘤细胞的坏死率及凋亡率无显著提高。