肿瘤患者血清中岩藻糖基转移酶FUT4检测方法的建立及其临床意义

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:wjp711018
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目的:肿瘤异常糖基化与肿瘤的转移、生长、恶性程度及其预后密切相关。岩藻糖基转移酶(Fucosyltransferases,FUTs)是催化岩藻糖化糖蛋白糖链合成的糖基转移酶。根据岩藻糖基转移酶催化生成的岩藻糖化糖链类型不同,可将岩藻糖基转移酶分为13种,其中岩藻糖基转移酶Ⅳ(FUT4)是α1,3岩藻糖基转移酶,催化GDP-α-L-Fuc底物,岩藻糖基通过α-1,3糖苷键连接于糖链外侧或内部的GlcNAc上。岩藻糖基转移酶FUT4已被证实在多种上皮来源的肿瘤中表达异常升高。本实验的目的是建立一种适合临床检验的血清中FUT4测定方法,通过分析肿瘤患者中血清FUT4的表达情况,为肿瘤的临床的诊断提供依据。方法:样本收集:分别选择正常人血清300例及肿瘤患者血清370例,包括胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌六种。1、ELISA方法检测血清中FUT4含量方法如下:实验中设置空白、阴性、阳性对照主要步骤包括加待检血清→封闭液→FUT4抗体→HRP标记IgG抗体→加入底物显色→加入终止液;为了优化FUT4检测条件分别对FUT4抗体,阳性对照A431细胞,HRP标记IgG抗体进行条件确定。(1) FUT4抗体最佳浓度测定:FUT4抗体配制成1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000,测定OD450值作图分析,确定最佳浓度。(2)HRP标记IGg抗体浓度测定:二抗抗体配制成1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000。测定OD450值作图分析,确定最佳浓度。(3)阳性对照浓度的确定:将人子宫内膜移行上皮细胞癌A431稀释成1:50、1:100、1:200、1:300、1:400,测定OD450值作图分析,确定最佳浓度。(4)测定:用确定好的条件测定肿瘤患者血清FUT4的OD450值。2、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)定性检测血清中的FUT4含量,选择NC膜为固相载体加入待检血清→FUT4抗体→HRP标记IgG抗体→DAB显色。3、Western blot方法进一步检测血清中FUT4含量。结果:(1) ELISA方法检测FUT4的条件确定:确定血清工作浓度为90ul;FUT4抗体的工作浓度是1:3000;阳性对照A431细胞蛋白裂解液工作浓度为1:200; HRP标记IgG抗体工作浓度为1:4000;血清包被的条件是4°C过夜;FUT4反应时间为2小时;HRP标记IgG抗体反应为1小时;封闭时间为37°C2小时;显色时间为20分钟。(2)将正常人和不同肿瘤患者之间测定值用Spss13.5进行统计学分析。肿瘤患者血清FUT4水平均明显高于正常组,差异具有统计学意义(p<0.01);其中FUT4表达含量依次是胃癌>卵巢癌>乳腺癌>结肠癌>肺癌>肝癌。(3)Dot-ELISA法显示在肿瘤患者血清中的FUT4含量高于正常人血清中的FUT4含量。(4)Western blot实验进一步显示肿瘤组阳性条带检出率均高于正常组,胃癌、乳腺癌和卵巢癌的条带检出率显著高于正常组和其他肿瘤组。结论:(1)建立检测FUT4的ELISA方法,所建立的ELISA法具有灵敏、特异的特点,可用于检测人血清中的FUT4含量。在肿瘤患者血清中FUT4含量高于正常人血清中FUT4含量,肿瘤患者中以胃癌、卵巢癌、乳腺癌的表达尤为显著,(2)Dot-ELISA方法和Western blot法进一步分析ELISA方法检测结果显著性差异趋势一致,以上结果表明FUT4是一个潜在的肿瘤标志物可初步用于临床肿瘤的早期诊断。
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