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目的:以糖尿病肾病模型KKAy小鼠肾小管上皮细胞转分化肾间质纤维化与Notch/snail1信号转导通路激活有关为切入点,探讨以"肾痿"假说为指导的复方中药糖肾平对糖尿病肾病后期出现肾小管上皮细胞转分化的干预情况及可能机制。应用新方法诱导存在肾间质纤维化的糖尿病肾病KKAy小鼠动物模型的建立,通过体外动物实验及细胞实验研究糖肾平对糖尿病肾病与高糖培养引起的肾小管上皮细胞转分化、肾间质纤维化的作用;以及其通过干预Notch/snail1信号转导通路激活,糖肾平对糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化、肾间质纤维化的抑制作用机制;从多角度多层次,探讨糖肾平抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化、肾间质纤维化延缓糖尿病肾病进展的作用机制,为进一步研究糖肾平功效及机制提供实验依据,为"肾痿"假说提供实验依据。方法:1.整体动物实验:1.1SPF级雌性8~10周龄KKAy小鼠60只,SPF级雌性8~10周龄C57BL/6J小鼠10只。实验动物于洁净动物橱中饲养,适应性喂养1周,自由饮水及进食,KKAy小鼠喂食高脂高蛋白饲料,C57BL/6J小鼠喂食普通饲料。饲养环境为室温(23±2)℃,相对湿度(55±10)%,每日12h光照维持,昼夜循环。1.210周后测血糖,自小鼠尾静脉采血,当随机静脉血糖≥16.7mmol/L时,确认为糖尿病小鼠模型建立成功。1.3糖尿病模型建立成功的KKAy小鼠,小鼠24h尿液应用小鼠专用的代谢笼收集,并统计尿量,只有当24h尿白蛋白定量大于0.4mg/24h才能确定糖尿病肾病小鼠动物模型的建立。同时同周龄的10只雌性C57BL/6J小鼠一直喂养进食普通鼠饲料,作为正常对照组。1.4将模型小鼠按体重区段随机分为:模型组、厄贝沙坦组、糖肾平小、中、大剂量组。糖肾平的各剂量组将按照临床患者用药剂量给药,即小剂量组3.5倍(0.525g·kg-1·d-1)、中剂量组7倍(1.05g·kg-1·d-1)、大剂量组 14倍(2.1mg·kg-1·d-1);厄贝沙坦组按临床患者用药剂量10倍(25mg·kg-1·d-1)。给药方式为灌胃给药,正常组以及模型组的小鼠替换为等体积的去离子水灌胃,按体重系数0.1mL/10g/天,确定灌胃剂量。以上各组小鼠均按组分笼饲养,KKAy小鼠继续给予专用高脂高蛋白饲料,C57BL/6J小鼠进食普通饲料,自由饮水及进食喂养。每天更换垫料,用药16周后取材。1.5观察各组小鼠的一般情况,包括精神、活动度、进食饮水量、监测体重、外表皮毛等,监测血糖,外周血检测血脂、肾脏功能、24小时尿检测尿蛋白定量变化。肾组织分别包埋进行光镜切片HE染色、Mallory染色及电镜观察糖肾平对糖尿病肾病小鼠肾脏肾间质纤维化病理形态的影响,并应用免疫组化、原位杂交、Westernblotting方法观察肾脏组织α-SMA、E-cad、Jagged1、Notch1、Hes1、snail1的变化情况。2.体外培养肾小管上皮细胞2.1 细胞培养:体外高糖培养小鼠肾小管上皮细胞,应用高糖诱导上皮细胞的转分化。2.2 细胞处理及分组:小鼠肾小管上皮细胞种植于25cm2培养瓶,培养于37℃、5%CO2培养箱中,培养液:培养基加10%胎牛血清、青霉素及链霉素。用0.25%胰蛋白酶消化进行细胞传代,细胞再覆盖约80%培养瓶底左右后,用无血清培养基对细胞进行24h同化,然后分成7个不同处理组:正常对照组、高糖组、高糖加γ-分泌酶抑制剂组、高糖加小、中、大剂量糖肾平组、高糖加厄贝沙坦组,培养48小时收集小鼠肾小管上皮细胞,提取细胞蛋白及mRNA,实时荧光定量PCR、Westernblotting检测肾小管上皮细胞α-SMA、E-cad、Jagged1、Notch1、Hes1、snail1的蛋白及mRNA表达水平。2.3 MTT实验:肾小管上皮细胞种植于96孔板中,3000个细胞/孔。用无血清1640培养基孵育后,随机分为正常对照组、高糖组、厄贝沙坦含药血清组,糖肾平的低、中、高含药血清组和DAPT组,分别在高糖及含药血清处理的12、24、48、60小时。在492nm处用分光光度计检测光密度(OD值)。观察高糖对体外培养小鼠肾小管上皮细胞12、24、48、60小时增殖及转分化的影响,以及糖肾平含药血清对高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞增殖和转分化的作用结果:1.动物实验1.1糖肾平对DNKKAy小鼠作用:与模型组比较,糖肾平小、中、大剂量组小鼠一般状态改善、体质量均有不同程度减轻,给药16周后糖肾平中、大剂量组小鼠体质量明显减轻(P<0.01),肾质量与体质量比值显著降低(P<0.01),24h尿蛋白定量显著减少(P<0.01),血清BUN含量显著降低(P<0.01),TG、Scr含量降低(P<0.05),肾脏病理改变明显减轻。糖肾平大剂量组基底膜厚度明显减小(P<0.01),与模型组比较,糖肾平小、中、大剂量组氧化应激指标改善,NO、SOD含量显著升高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01)。1.2糖肾平对DNKKAy小鼠肾组织Notch/snail1信号转导通路各指标、α-SMA、E-Cadherin蛋白及mRNA表达的影响:与模型组相比,糖肾平治疗组jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA蛋白和mRNA水平明显降低(P<0.01),糖肾平大剂量组效果更佳,E-Cadherin蛋白和mRNA表达显著增高(P<0.01),与糖肾平中、小剂量相比,糖肾平大剂量E-Cadherin蛋白和mRNA表达升高更多(P<0.05)。2.细胞实验2.1糖肾平对高糖培养小鼠肾小管上皮细胞增殖的影响:与高糖组相比各治疗组在24h吸光度较高糖组低(P<0.05),48h时与高糖组相比,高糖加糖肾平大剂量组增殖抑制明显(P<0.01)。高糖加糖肾平小、中剂量组与高糖组相比有统计学意义(P<0.05),60h时糖肾平各剂量组吸光度与高糖组相比均明显减小(P<0.01)。2.2糖肾平对高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞Notch/snail1信号转导通路各指标及α-SMA、E-Cadherin蛋白及mRNA表达的影响:与正常组相比,高糖组肾小管上皮细胞 jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA 蛋白和 mRNA 蛋白和 mRNA 水平明显增高(P<0.01),E-Cadherin蛋白和mRNA表达显著减小(P<0.01)。与高糖组相比较,糖肾平含药血清大剂量组足细胞jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA蛋白和mRNA蛋白和mRNA水平明显降低(P<0.01)。E-Cadherin蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.01)。与糖肾平含药血清小剂量组相比,大剂量组改善更为显著(P<0.05)。结论:1.糖肾平可以改善糖尿病肾病KKAy小鼠的糖尿病症状,改善糖尿病肾病氧化应激状态,减轻糖尿病肾脏损伤降低蛋白尿保护肾功能,延缓糖尿病肾病肾小管上皮转分化肾间质纤维化的进程其疗效呈剂量依赖型。2.糖肾平可以上调小鼠肾组织中E-Cad的表达抑制糖尿病肾病KKAy小鼠肾脏肾小管上皮细胞转分化,延缓肾间质纤维化。3.糖肾平可以通过干预糖尿病肾病KKAy小鼠肾组织Notch/snail1信号转导通路上各组成分子的蛋白及mRNA的表达,抑制肾小管上皮细胞转分化的发生以及进一步发展为肾间质纤维化。4.糖肾平可以抑制高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞增殖和凋亡,并且上调高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞E-Cad蛋白及mRNA表达,抑制α-SMA蛋白及mRNA表达从而抑制高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞转分化。5.糖肾平可以通过干预高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞中Notch/snail1信号转导通路蛋白及mRNA的表达,抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化。