研究背景原发性肝癌正在以每年超过一百万人的速度递增,而且因极差的预后成为世界上三大恶性肿瘤之一,虽然外科手术是原发性肝癌首选治疗方法,但是仅有10%~20%的新诊患者适合手术治疗,此外,多数患者就诊时已属中晚期,手术切除率仅为30%左右,且手术复发率较高,所以对于无法手术治疗的患者,放疗显得尤为重要,重离子被公认为是最理想的放疗射线,适宜于手术、化疗、常规放疗无效或易复发的难治病例,但和其他放疗一样,重离子束辐射对患者造成的损害成为其在临床应用的瓶颈,同时肿瘤放射治疗失败的原因之一是肿瘤组织的放射抗拒性,使得肝癌的根治剂量明显高于肝脏的耐受剂量,尤其是中晚期肝癌患者多数都有基础肝病,又限制了放疗剂量的提高,导致肝癌放疗效果不佳,如果能选择增加肝癌细胞辐射敏感性的药物与放疗联合应用,从而相对提高中晚期肝癌放疗疗效,在临床应用中具有重要的价值。因此需要寻找有效的且毒副作用低的放疗增敏药物,针对肿瘤组织以提高其辐射敏感性,降低肿瘤组织的辐射抵抗,同时减低对周围正常组织的毒副作用具有重要意义,从而为提高肝癌的放疗效果提供新的思路,尤其是从天然植物或药物中提取、纯化有效的抗肿瘤成分已成为一种新的趋势。临床及药理研究发现,当归、红芪具有一定的抗肿瘤和提高免疫功能的作用。实验证实,当归、红芪有效成分可抑制肿瘤细胞增殖、增强机体免疫、保护造血系统、清除自由基等作用,本研究借助人肝癌HepG2和H22细胞株,采用12C6+束辐射,辅以超滤技术提取纯化的当归红芪超滤物干预,观察其在12C6+束辐射肝癌HepG2和H22细胞过程中的增敏作用,并进一步探讨其发生的作用机制,为甘肃道地药材当归红芪在放疗增敏的临床应用提供一定的实验依据。研究目的探讨当归红芪超滤物(Radix Angelicae Sinensis and Radix Hedysari,RAS-RH)增强肝癌细胞株的辐射敏感性和作用机制。研究内容包括两部分:第一部分,从当归红芪超滤物的制备、细胞增殖抑制、形态改变、克隆集落形成的角度研究当归红芪超滤物对肝癌HepG2和H22细胞的辐射增敏作用;第二部分,从细胞周期阻滞、dna损伤修复、细胞凋亡的角度探讨当归红芪超滤物对肝癌hepg2和h22细胞辐射增敏的作用机制。研究方法1、采用超滤膜分离技术制备当归红芪超滤物(ras-rh),并利用高效液相和质谱进行分析。2、利用cck-8法检测当归红芪超滤物(ras-rh)对肝癌hepg2和h22细胞的增殖抑制率,并筛选出ic20;3、应用倒置相差显微镜和透射电镜观察当归红芪超滤物(ras-rh)对肝癌hepg2和h22细胞经12c6+束辐射后细胞形态结构变化的影响;4、利用克隆集落形成实验观察当归红芪超滤物(ras-rh)对肝癌hepg2和h22细胞经12c6+束辐射后细胞克隆形成的影响,计算克隆形成率及细胞存活分数,同时利用线型二次方程insf=αd+βd2模型进行细胞存活曲线拟合,分析辐射敏感性参数α、β和sf2值的变化;5、利用单细胞凝胶电泳检测当归红芪超滤物(ras-rh)对肝癌hepg2和h22细胞经12c6+束辐射后dna损伤的影响;6、利用免疫荧光共聚焦法检测当归红芪超滤物(ras-rh)对肝癌hepg2和h22细胞经12c6+束辐射后γ-h2ax的影响;7、利用流式细胞术检测当归红芪超滤物(ras-rh)对肝癌hepg2和h22细胞经12c6+束辐射后的细胞周期、凋亡率的影响;8、用westernblotting法检测当归红芪超滤物(ras-rh)对g2/m期检验点相关因子chk-2,cdc-2,atm蛋白表达水平的影响;9、用westernblotting法检测当归红芪超滤物(ras-rh)对dna修复相关因子rad51,ku70,γ-h2ax蛋白表达水平的影响;10、用westernblotting法检测当归红芪超滤物(ras-rh)对凋亡相关因子survivin,caspase-9蛋白表达水平的影响;研究结果1、高效液相和质谱结果:当归红芪水提物、超滤物色谱图比较一致,说明超滤提取技术并没有改变药液中的主要化学成分,超滤提取技术能够有效地除去鞣质、蛋白质等大分子杂质,相比较水提法能够提高当归红芪中的多糖、芒柄花素和阿魏酸的含量,同时发现100kda截留分子量的膜具有较好的分离效果。2、cck-8法实验结果:100kda的ras-rh能抑制肝癌hepg2和h22细胞的增殖,呈现一定的时间、剂量依赖性,其ic20为117.6±2.15mg/l;3、形态学观察:利用倒置相差显微镜发现,对照组的hepg2和h22细胞生长良好,轮廓清晰,形态规整,生长旺盛,而药物组、辐射组、联合组的细胞生长受到抑制,联合组细胞的生长抑制表现最为明显,细胞体积缩小且不规则。透射电镜观察到对照组hepg2和h22细胞的细胞膜完整,细胞核和细胞器等超微结构清晰;药物组、辐射组的细胞膜基本完整,细胞核、细胞器等超微结构基本清晰,但联合组细胞内微绒毛减少,基质逐渐消失,胞核内的染色质浓缩,聚集在核膜周边,出现环状改变。4、克隆集落形成实验结果:相同辐射剂量下,在联合组随着ras-rh浓度的增加(50、100、200mg/l),hepg2和h22细胞克隆存活率有了明显的下降,按线型二次方程insf=αd+βd2模型拟合生存曲线,拟合的hepg2和h22细胞生存曲线均向右下呈弧度的曲线,两条曲线明显分开呈一定的距离;联合组与辐射组相比,曲线低剂量区“肩区”缩小变窄,且各剂量点的存活率降低,计算hepg2细胞辐射增敏比(ser)为1.37±0.06,h22细胞ser为1.39±0.07,由上述结果可知,ras-rh对两株肝hepg2和h22细胞都具有很好的辐射增敏效果,可以增加hepg2和h22细胞的辐射敏感性。5、单细胞凝胶电泳检测结果:经过casp软件分析,联合组的headdna、taildna、tm、otm与辐射组相比,差异具有显著性(p<0.05),说明随着ras-rh浓度的增加,hepg2和h22细胞的dna损伤越严重,另外,在联合组和辐射组相比,随着时间的延长,hepg2和h22细胞的otm差异具有显著性(p<0.01),拟合各实验组在不同时间点的dna损伤修复曲线发现,与辐射组相比,联合组的dna双链损伤的半数修复时间延长。6、流式细胞仪检测细胞周期:hepg2和h22细胞用不同浓度ras-rh(50、100、200mg/l)处理24h后,g2/m期细胞在细胞周期中所占比率随着ras-rh浓度增加而增加,同时发现,不同浓度ras-rh(50、100、200mg/l)联合2gy12c6+束处理后24h,随着ras-rh浓度的增加,细胞发生了明显的周期阻滞现象,说明ras-rh联合12c6+束处理hepg2和h22细胞,可以增加细胞周期在g2/m期的阻滞。7、免疫荧光共聚焦法检测结果:在0.5~12h,药物组与对照组细胞的γ-h2ax聚集点变化不明显,两者比较没有差异性(p>0.05);辐射组hepg2和h22细胞的γ-h2ax聚焦点形成迅速,于0.5h达到峰值,接着随着时间的推移,γ-h2ax聚集点逐步降低,8h后,与药物组、对照组比较没有差异性(p>0.05);联合组细胞的γ-h2ax聚焦点形成也迅速,并且于0.5h达到峰值,但是,随着时间的推移(2~12h),γ-h2ax聚焦点减低不明显(p>0.05),表明辐射后损伤的dna没有被修复;另外,在2~12h的时间点,联合组细胞γ-h2ax聚集点要高于辐射组,两者差异具有差异性(p<0.05),表明,随着时间的延长(2~12h),联合组γ-h2ax聚集点没有明显消退,损伤持续存在。8、流式细胞仪检测细胞凋亡:不同浓度RAS-RH(50、100、200mg/L)联合2Gy 12C6+束对HepG2和H22处理后24h,随着RAS-RH浓度的增加,HepG2和H22细胞的凋亡率都有了显著的增加,说明RAS-RH联合12C6+束处理HepG2和H22细胞,可以增加其凋亡,随着RAS-RH浓度的增加,其凋亡率也增加。9、Western blotting检测结果:RAS-RH上调G2/M期调控的关键蛋白CHK-2,CDC-2,ATM的表达,使HepG2和H22细胞被阻滞在对辐射敏感的G2/M期。10、Western blotting检测结果:RAS-RH下调DNA修复相关蛋白Rad51,Ku70的表达,抑制γ-H2AX蛋白的修复作用,造成DNA双链损伤后修复被抑制。11、Western blotting检测结果:RAS-RH通过下调Survivin蛋白表达,上调Caspase-9蛋白表达,使DNA双链损伤后的细胞凋亡率增加。结论当归红芪超滤物可以增加肝癌HepG2和H22细胞对12C6+束的辐射敏感性,其作用机制主要在于通过上调周期检验点蛋白ATM、CHK-2,CDC-2表达,将细胞阻滞在辐射最为敏感的G2/M期,下调DNA修复中重要因子RAD51、Ku70表达,抑制γ-H2AX蛋白的修复作用,造成DNA双链损伤后修复被抑制,最终通过Survivin和caspase-9参与的线粒体凋亡途径增加细胞凋亡。综上所述,当归红芪超滤物有希望成为放射增敏剂。