创伤后应激障碍综合征(posttraumatic stress disorder, PTSD)是一种由经历生命威胁或灾难性事件所引发的强烈的恐惧感、无助或厌恶等严重的焦虑症。对患者社会和家庭生活、身心健康造成长期的不良影响。PTSD可以分为急性PTSD和慢性PTSD两类：如果PTSD症状持续不超过3个月,称为急性PTSD,否则称为慢性PTSD。有调查显示大约有60.7%的男性和51.2%的女性在他们一生中至少会经历一次创伤事件。女性创伤后应激障碍的发病率显著高于男性,不同人群的PTSD患病率也存在巨大的差异,在中国是大约为0.3%,新西兰约为6.1%,美国约为6.8%。因此有效地预防(主要针对手术患者)和治疗PTSD,是目前医学研究的一个热点。PTSD的三大主要症状为：个体对创伤情境的再体验；主动回避一些可能引发创伤体验的事、物；对许多小的细节件都引起比较强烈的反应,即高度应激。引发创伤体验的事、物通常会引发前两个症状,而高度应激状态则更多的表现为持续的存在。PTSD症状核心是加强的对创伤事件的恐惧学习。虽然恐惧学习是一个有益的反应机制,当它被扩大化后危害很多。当针对创伤事件的恐惧学习被泛化到平时通常认为安全的环境中将导致与环境不相称的高度警觉。在极端刺激和伤害下,刺激引发的去甲肾上腺素系统(norepinephrine, NE)系统的敏化和NE作用时间延长,这可能使个体有适应不良的表现。除了伤害事件发生时NE导致的神经元电路长时间改变,有证据进一步显示,在PTSD中NE系统可能也发生一定的调节异常。特别指出的是,在PTSD中NE系统似乎是反应过度的。PTSD的多种症状与中枢去甲肾上腺素系统过度激活有关,如反应过度,创伤体验重现和睡眠障碍。大量的人类与动物研究和临床证据显示NE系统参与行为和认知过程中有重要作用,比如对恐惧的记忆和学习。右美托咪定是一个强有力和高选择性的α2肾上腺受体激动药物,激动中枢突触前α2受体,从而发挥镇痛,以及麻醉镇静的作用(cooperative sedation)。右美托咪定是国内近几年才开始使用的镇静镇痛药,而美国食品药品管理局已于1999年批准用于重症监护病房机械通气患者最初24h的镇静。其主要是通过抑制腺苷酸环化酶活性,减少细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,CAMP)的生成和开放K十通道增加突触后膜K+的通透性等作用机制而产生膜超极化现象抑制中枢神经系统释放甲肾上腺素,从而发挥镇静镇痛作用,蓝斑核是其产生作用的重要部位,而蓝斑核是中枢系统中NE的重要来源。既往研究发现在小鼠巴甫洛夫条件性恐惧训练前腹腔给予右美托咪定,可抑制恐惧线索记忆的形成,但不影响环境记忆；在训练后给药可阻止环境记忆的产生。近期研究指出药理学途径破坏NE的神经传递对PTSD中的由于恐惧学习强化导致的相关症状如,高度应激是有效的。PTSD的动物模型有多种,比如经典的巴普洛夫模型和强迫游泳模型。虽然大多数PTSD的模型都限制于评估可测量和观察到的指标并且不能对复杂的PTSD症状比如,侵扰性想法等进行有效评估,但是有效可靠的动物模型可以为PTSD分子生物学、病理生理学以及药理学方面的研究提供研究途径,而这些是在人体研究上是不能做到的。大多数基于创伤刺激的模型主要是通过给予动物严重的创伤应激,诱导动物发生类似PTSD的行为状态,测试动物行为和生理的变化,研究主要集中于联想性学习的恐惧条件化过程(fear conditioning)和非联想性学习形成的敏感化行为(sensitization)。本实验将采用Rau等报道的PTSD模型,是一种新型的条件性恐惧模型,大鼠首先在A室接受15次电击刺激,第二天首先观察大鼠在不同环境的B室基础木僵率然后接受单次电击刺激,第三天观察大鼠在B室的木僵率,此时出现B室木僵率的明显延长—应激增强的恐惧学习(Stress-enhanced fear learning, SEFL)现象类似PTSD特征症状,即无害的中性刺激可引发符合原始创伤事件的过度反应。突触可塑性改变是学习记忆功能重要分子学,既往研究显示活动调节骨架蛋白(activity-regulated-cytoskeletal protein, Arc)基因敲除的动物都有一种普遍的表现：短期记忆正常而长期记忆却不能形成,这就说明Arc对于记忆的巩固有重要的作用。但是对于不同的刺激和信号通路,Arc有多种多样的功能和反应。所以活动调节骨架蛋白通过多种机制参与突触可塑性改变,进而参与记忆形成的调节。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, Erk)是Arc转录合成信号通路上游的重要节点。所以本研究拟观察预防性给予不同剂量的右美托咪定对创伤后应激障碍模型大鼠的行为学影响,并分析了其对Erk磷酸化及Arc表达的影响,以理解其效应的分子机制。目的：利用已经掌握的实验手段(PTSD大鼠的行为学测定手段、中枢核团微量蛋白分析的分子生物学的测定方法)评价不同浓度、给药时间点给予右美托咪定预防大鼠创伤后应激障碍(PTSD)的效果及其对海马细胞外信号调节激酶(Erk)活性及活动调节骨架蛋白(Arc)表达的影响,并进一步探讨右美托咪定预防PTSD的效果。方法：取成年雄性Sprague-Dawley大鼠100只,体重250-280g,采用随机数字表法,将大鼠分为四组(n=25)：生理盐水组(NS组)、右美托咪定0.3μg/kg组(D1组)、右美托咪定3.0μg/kg组(D2组)和右美托咪定9.0μg/kg组(D3组)。于PTSD模型制备前30min, NS组腹腔注射生理盐水2ml,D1组、D2组和D3组腹腔注射右美托咪定0.3、3.0和9.0μg/kg。每组随机取16只大鼠在第一天A室训练结束后15min、30min、60min、90min处死,留取海马组织,采用免疫印迹方法(Western blot)检测大鼠海马细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulated kinase, Erk)、磷酸化Erk及活动调节骨架蛋白(activity-regulated-cytoskeletal protein, Arc)的表达水平,其余进行第2天和第3天的行为学测试,记录木僵率。PTSD模型制备方法：大鼠在第一天在A室接受15次电击处理(每次1mA,持续1s,间隔240-480s),第二天在与A室环境完全不同的B室,记录大鼠木僵率,然后给予1次电击(1mA,持续1s),32s后从B室移出；第三天将大鼠放入B室,进行一个8分32秒的测试,记录大鼠木僵率。若第三天时木僵率显著高于第二天则表明模型制备成功。结果数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间、组内比较比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间均数两两比较,若方差齐时采用LSD检验,方差不齐则采用Dunnett’s T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.行为学结果：第一天时四组木僵率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与第二天时比较,各组大鼠第三天时木僵率升高(P<0.05)；与NS组比较,D2组和D3组第三天时木僵率均下降(P<0.05),D1组差异无统计学意义(P>0.05)；D2组和D3组第三天时木僵率比较差异无统计学意义(P>0.05)。2. Western blot结果：2.1大鼠海马Erk及磷酸化Erk表达水平的变化A室训练结束后各时间点NS组总Erk表达水平无统计学差异(P>0.05)。NS组海马磷酸化Erk42/44的水平在第一天A室训练结束后15min明显升高(P<0.05)。四组大鼠海马Erk表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与NS组相比,第一天A室训练结束后D2组和D3组15min大鼠海马的海马磷酸化Erk的水平随着右美托咪定的剂量增加而显著降低(P<0.05),D1组差异无统计学意义(P>0.05)；D2组和D3组海马磷酸化Erk表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。2.2大鼠海马Arc表达水平NS组海马Arc的表达在第一天A室训练结束后30min明显升高(P<0.05)。与组NS组比,第一天A室训练结束D2组和D3组30min后的海马Arc表达水平随着右美托咪定的剂量增加而显著降低(P<0.05)；D1组差异无统计学意义(P>0.05)；D2组和D3组海马Arc表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论：对于创伤事件恐惧记忆的形成是PTSD发生和发展的基础。Rau等人的研究指出第一天大鼠在A室接受到15次电刺激的恐惧学习训练是第三天B室出现SEFL的关键。海马是条件性恐惧学习的重要神经结构,它为恐惧记忆的核心核团—基底外侧杏仁核提供环境信息。Arc在基于长时程记忆(long-term memory,LTM)的突触塑形中有重要作用。近期研究发现其也参与学习记忆过程。Erk是Arc转录合成信号通路上游的重要节点,ERK活性增强时Arc转录合成也相应增加。右美托咪定可能通过抑制海马ERK活性,从而降低了与记忆获得和LTM密切相关的Arc的表达,抑制创伤事件恐惧记忆的形成,从而对大鼠PTSD产生一定预防作用。本实验首次发现右美托咪定对于PTSD有预防作用,因此使用右美托咪定对于在全身麻醉过程中有术中知晓的病人也可降低其发生PTSD的风险。