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目的:
幽门螺杆菌(Heliocbacter pylori,H.pylori)的某些毒力因子是通过Cag致病岛(cag pathogenicity island,Cag-PAI)编码的Ⅳ型分泌系统(typeⅣ secretion system,TFSS)转运进入胃粘膜细胞而发挥毒性作用。目前已知幽门螺杆菌的Ⅳ型分泌系统蛋白的编码基因有27种,但多数基因的功能尚未十分清楚。本文以cagY/hp0527基因和hp0523基因为研究对象,探讨它们在Ⅳ型分泌系统转运毒力因子过程中的作用,为进一步研究Ⅳ型分泌系统的转运机制和深入阐明幽门螺杆菌的致病机制奠定基础。
方法:
1.根据GenBank收录的H.pylori22695全基因组序列,利用生物信息学软件Primer Primier5.0设计扩增引物,获取hp0527-C和hp0523基因,T-A克隆后构建pMD18-T-hp0527-C和pGEM-T-hp0523载体,进行序列测定；并对其序列进行生物信息学分析研究；
2.构建pET-28a-hp0527-C和pET-28a-hp0523原核表达载体,转化表达宿主菌BL21(DE3)；经IPTG诱导后,SDS-PAGE法和Western blot法鉴定表达后,并以Ni2+-NTA柱分离纯化目的蛋白；进一步对纯化蛋白进行生物学活性研究；
3.纯化后的HP0527-C融合蛋白免疫家兔,制备抗HP0527-C多克隆抗体,应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清抗体效价。
4.HP0527-C融合蛋白与BGC-823细胞作用一定时间,提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-8 mRNA的表达；并用四甲基偶氮唑蓝(㈣检测蛋白对BGC-823细胞增殖的影响。
5.扩增获得hp0527和hp0523基因上、下游同源臂片段F1、F2,构建自杀质粒pBlueKM40/△hp0527::Kmr,pBlueKM40/Ahp0523::Kmr,电击转化H.pylori后经抗生素筛选hp0527和hp0523基因缺失株,再进行PCR鉴定；
6.采用hp0527和hp0523基因缺失株和野生株与胃癌上皮细胞BGC-823进行共培养,而后采用Western blot法检测CagA蛋白转运能力变化。
结果:
1.扩增获得的hp0527-C基因全长1494bp,编码498aa,与根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,A.tumefaciens)的VirB10具有较高的同源性；hp0523基因全长为510 bp,编码169 aa,与GenBank公布的26695、J99同源性为92～95％；蛋白相对分子量Mr预测为19.7 kDa,等电点pI为9.53；蛋白二级结构分析,在33～165位aa之间存在一个保守的SLT催化基序,第56位谷氨酸(GLU56)是催化活性的中心位点,C端序列上含有一个肽聚糖结合域“AVGAY”,故预测hp0523基因可能是一个肽聚糖水解酶编码基因；
2.构建获得了原核表达载体pET-28a-hp0527-C和pET-28a-hp0523,IPTG诱导后,经SDS-PAGE鉴定和Western blot鉴定有目的蛋白表达；采用Ni2+-NTA柱梯度洗脱后,分离获得了目的蛋白HP0527-C和HP0523；HP0527-C融合蛋白免疫家兔,获得抗HP0527-C多克隆抗体的效价为1:1.6×104。
3.终浓度10μg·ml-1的HP0527-C融合蛋白作用于胃癌上皮细胞BGC-823细胞4h后,可扩增出IL-8片段；不同浓度的HP0527-C融合蛋白与BGC-823细胞作用6、12、24及48h后,细胞增殖的程度随着HP0527-C融合蛋白浓度的增高和作用时间的延长而逐渐降低。
4.HP0523经复性处理后,采用溶菌斑点实验证实其具有溶菌活力；而后采用SDS煮沸法分离提取获得细菌肽聚糖,进行凝胶酶谱分析后,发现HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力；理化特性研究表明,HP0523具有广谱的溶菌能力,但酶活力较溶菌酶低；其最适酶活力pH值为6.0;
5.连接F1、F2后构建自杀质粒pBlueKM40/△hp0527::Kmr,pBlueKM40/△hp0523::Kmr电击转化后经抗生素筛选,并经PCR验证后获得了hp0527和hp0523基因缺失株；缺失株、野生株分别与胃癌上皮细胞BGC-823进行共培养后,发现hp0527和hp0523基因缺失株处理组,胃癌上皮细胞内未能检测到CagA的转运。
结论:
1.本研究成功克隆了hp0527-C基因,是H.pylori cag PAI编码的TFSS的结构基因之一。构建了原核表达载体,获得了HP0527-C融合蛋白,其融合蛋白可诱导胃癌上皮细胞BGC-823细胞表达IL-8 mRNA,24h表达量最高,同时对细胞的增殖有一定抑制作用。
2.本研究结果提示:hp0527基因为TFSS结构基因；hp0523基因为肽聚糖水解酶,参与CagA的转运。