D-阿洛酮糖（D-allulose,也称D-psicose）作为一种低热量的功能性糖,是一种很好的蔗糖替代品,同时也是公认的第四代天然甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose3-epimerase,DPE）可以专一催化D-果糖转化生成D-阿洛酮糖,是工业上制备D-阿洛酮糖的关键酶。本课题将Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE在枯草芽孢杆菌中进行重组表达,并在转录水平和翻译水平上分别对其启动子和核糖体结合位点（Ribosome Binding Site,RBS）进行筛选优化。然后在发酵工程水平上,通过摇瓶发酵和3 L罐发酵优化,进一步提高DPE的表达量。最后本课题对重组菌株全细胞在制备D-阿洛酮糖中的应用进行研究,为工业生产制备D-阿洛酮糖奠定基础并提供理论支持。主要的研究内容与结论如下:（1）以质粒p P43NMK为骨架,构建DPE在宿主菌B.subtilis WB800中的重组表达质粒。为了提高DPE的表达量,首先考察了9种单启动子Pamy E、Papr E、Pgsi B、Phag、PHpa II、Pnpr E、P43、Psig X和Pylb P介导的重组菌株在表达DPE上的差异。经摇瓶发酵培养,发现表达效果最好的单启动子为Phag,对应重组菌株的酶活为19.62 U/m L,其次是单启动子Pylb P和P43,对应的酶活分别为16.62 U/m L和15.05 U/m L。将单启动子Phag、Pylb P和P43进行两两/重复串联,构建9种串联启动子Phag-P43、PP43-hag、Pylb P-hag、Phag-ylb P、Pylb P-P43、PP43-ylb P、PP43-P43、Pylb P-ylb P和Phag-hag介导的重组菌株,经摇瓶发酵培养后,效果最好的串联启动子是Pylb P-Pylb P,酶活为17.95 U/m L,效果略低于单启动子Phag。（2）为了提高DPE的翻译水平,以单启动子Phag的RBS序列为研究对象,对其中的一部分碱基进行突变,构建15株重组突变菌株。实验结果表明,B.subtilis WB800/p P43NMK-hag-R4-DPE的酶活最高,为25.39 U/m L,比RBS序列优化前的重组菌株酶活提高了29.4%。（3）通过使用D-丙氨酸消旋酶基因代替抗生素抗性基因作为筛选标记,构建两种无抗表达质粒PUB-hag-R4-DPE-dal和p P43NMK-hag-R4-DPE-dal,将质粒转入实验室前期构造的D-丙氨酸缺陷型宿主菌B.subtilis 1A751-dal-后,摇床培养。两株重组菌株的酶活分别可达到24.72 U/m L和19.13 U/m L。（4）在摇瓶水平上考察培养基的组成成分对重组菌株产DPE的影响,实验结果显示,最适培养基的组分为:葡萄糖15 g/L、大豆蛋白胨16.1 g/L、酵母浸粉20 g/L、Na Cl8 g/L、Na2HPO4·12H2O 1 g/L、Mg SO4·7H2O 1 g/L,此时DPE酶活可增长至33.91 U/m L,比优化前培养基的酶活增长了41%。随后,在3L罐中对重组菌株B.subtilis WB800/p P43NMK-hag-R4-DPE的发酵条件进行进一步的优化,实验结果显示,当不调控p H,以40 m L/h的补料速率进行补料时,DPE的发酵酶活最高,为714.84 U/m L。（5）探究不同反应条件对产DPE的重组菌株全细胞催化生产D-阿洛酮糖时的影响,最适酶转化反应条件如下:当底物D-果糖浓度为45%（w/w）,反应温度55°C,加酶量30 U/g,调节p H至7.5,转速200 r/min时,D-阿洛酮糖的转化率可高达28.45%。当反应进行8h后,整个反应达到平衡状态。