论文部分内容阅读
目的:痛风性关节炎是由单钠尿酸盐(Monosodiumutate,MSU)沉积所致的晶体相关性关节病。在急性痛风性关节炎炎症活动中,NLRP3炎症小体起着重要的炎症枢纽作用。课题组前期通过Microarray筛选出痛风性关节炎特异表达的miRNAs,通过生物信息学预测miRNA223-3p与miRNA22-3p有共同的作用靶点—NLRP3。本实验主要研究miRNA223-3p与miRNA22-3p对MSU晶体诱导的痛风炎症中NLRP3的调控作用。方法:体内实验:1)使用BALB/C型小鼠进行气囊模型的构建。2)构建miRNA223-3p与miRNA22-3p的agomir与negative control组。分别给予MSU刺激相应时间后使用Q-PCR、western blot、ELISA实验手段观察各组NLRP3与IL-1 β表达量变化。3)通过对小鼠气囊滑膜上皮进行HE染色及NLRP3免疫组化图象分析,观察各组变化。体外实验:1)首先构建氟波酯(PMA)诱导后的THP-1巨噬细胞模型,给与MSU刺激后观察并确定MSU刺激浓度。分析细胞内NLRP3,miRNA223-3p与miRNA22-3p在MSU刺激后随时间的表达变化,找到细胞内炎症反应最佳观察时间点。2)将miRNA223-3p 与 miRNA22-3p 的 mimic 与 inhibitor 以及 negative control 通过细胞转染技术转入细胞,使用Q-PCR、westernblot、ELISA实验手段观察各转染组中NLRP3及IL-1 β表达量的相对变化。3)在THP-1巨噬细胞模型中进行双荧光素酶实验,验证 miRNA223-3p 与 miRNA22-3p 对于 NLRP3 3’-UTR 的端靶向作用。结果:体内实验:1)我们成功构建BALB/C型小鼠进行气囊模型。2)通过Q-PCR、western blot、ELISA 实验得到 miRNA223-3p 与 miRNA22-3p agomir 组气囊上皮组织中NLRP3与IL-1 β表达量及气囊液中IL-1 β表达水平较negative control组显著降低,差异有统计学意义。3)小鼠气囊上皮组织HE染色得出miRNA223-3p与miRNA22-3p agomir组的气囊上皮表面白细胞的募集较negative control组明显减少。同时NLRP3的免疫组化图像显示,miRNA223-3p与miRNA22-3p agomir组的气囊上皮NLRP3的表达较negative control组明显减少。体外实验:1)通过筛选我们发现以100 ng/ml氟波酯作用THP-1细胞72 h后可以得到稳定的巨噬细胞模型。MSU刺激浓度在100μg/ml时对细胞活性影响较少,作为最佳刺激浓度。在MSU刺激6h后,NLRP3在细胞中表达最高,且miRNA223-3p与miRNA22-3p表达水平较未刺激组显著降低(p<0.01)。2)通过Q-PCR与western blot 及 ELISA 实验得出 miRNA223-3p mimic 与 miRNA22-3p mimic 组中细胞内NLRP3,IL-1 β表达以及细胞外IL-1 β分泌水平较negative control组显著降低,同时 miRNA223-3p inhibitor 与 miRNA22-3p inhibitor 组较 negative control 组显著升高,均有统计学意义。3)双荧光素实验结果显示miRNA223-3p与miRNA22-3p对于NLRP3 3’-UTR端有靶向作用。结论:1)miRNA223-3p与miRNA22-3p与痛风炎症相关,在氟波酯诱导后的THP-1细胞内及BALB/C型小鼠气囊组织中均有表达,且在MSU刺激后两者表达下降。2)在痛风炎症的发展过程中miRNA223-3p与miRNA22-3p均可通过与NLRP33’-UTR端相结合,在mRNA蛋白转录后抑制NLRP3的表达,同时抑制细胞内IL-1 β的生成与释放,因此起到对痛风炎症的调节作用。