脐带血CD34+细胞来源的树突状细胞功能活性研究

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目的:探讨脐带血CD34+细胞来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)的大量体外扩增、培养方法,并鉴定扩增后树突状细胞的生物学特征、活性及介导的杀伤细胞抗肿瘤效应。  方法:收集健康足月产妇的新鲜脐带血,用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,利用CD34+磁珠进行阳性分选,然后将CD34+细胞接种到含有粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和干细胞因子(SCF)的培养基中连续培养30天,并计数细胞量。在培养过程中,收集第14天的部分细胞,加入到含有GM-CSF、白介素-4(IL-4)细胞因子的培养基中,诱导分化为未成熟DC。利用倒置显微镜对所诱导的DC细胞每日进行形态学观察,并分别于第1、3、5天利用流式细胞术(FCM)检测DC细胞的表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率及利用FITC-右旋糖苷实验检测DC吞噬能力。然后取培养第5天的未成熟DC细胞负载LST-174、paca肿瘤全抗原(肿瘤细胞裂解物),同时加入TNF-a,2天后经流式细胞术检测负载肿瘤全抗原的DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率。  利用人淋巴细胞分离液分离外周血,得到外周血T淋巴细胞,经含有IL-2的培养基继续培养扩增。在含GM-CSF、IL-4的培养基培养过程中,分别将第5天的未成熟DC细胞(负载抗原前)和培养第7天的成熟DC细胞(负载抗原2天)与T淋巴细胞混合培养24小时,用CCK-8试剂盒检测DC混合T淋巴细胞反应。将培养第7天的DC细胞(负载抗原2天)与T淋巴细胞混合培养2天,制备抗原特异性CTL,将CTL加入到96孔板中的LST-174、paca肿瘤细胞混合孵育24小时,同时设立空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照组,利用CCK-8检测DC介导的细胞毒性T淋巴细胞对两种肿瘤细胞的杀伤效应。  结果:1.可从50ml脐带血中平均分离约1.35*106个CD34+细胞,经30天连续培养,细胞数量由初始量平均扩增至1.47*1011个,平均扩增约109701倍;  2.在30天的培养过程中,选择了第14天的细胞加入含GM-CSF、IL-4的培养基继续培养一周,细胞贴壁并具有典型的DC细胞形态。在培养第1、3、5天用流式细胞术分别检测CD34+来源的DC表面分子CD80表达率分别为3.70±0.65%、14.53±0.97%、44.27±4.78%; CD83表达率分别为11.47±1.22%、40.70±3.73%、53.50±2.21%; CD86表达率分别为49.97±4.83%、71.37±2.66%、74.80±3.89%; HLA-DR表达率分别为45.53±1.84%、71.33±4.32%、74.80±4.53%。第7天(负载抗原后2天)的DC,经流式细胞术检测DC表面分子CD80表达率为92.06±1.92%,表面分子CD83表达率92.07±2.09%,表面分子CD86表达率94.43±1.67%,表面分子HLA-DR表达率87.80±3.37%  3.在培养第1、3、5天用流式细胞术检测CD34+来源的DC的吞噬能力,30分钟结果分别为61.83±4.10%、69.07±2.63%、75.87±2.49%;60分钟结果分别为60.73±2.68%、72.13±1.68%、78.97±2.41%。  4.在培养第5天,检测CD34+来源的DC(负载抗原前)和第7天(负载抗原后2天)的DC的混合T淋巴细胞反应,设置的E∶T=1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的6个不同比例均有对淋巴细胞的促增殖作用,其中1∶1、1∶2组促增殖作用最强,而1∶40组促增殖作用最弱。而负载抗原的成熟DC组的促增殖作用均高于未成熟DC组。  5.在培养第五天,制备肿瘤抗原负载的DC疫苗,激活T细胞生成CTL,对肿瘤细胞LST-174、paca在不同效靶比下均有杀伤作用,其中在40∶1效靶比下,杀瘤效率最高,LST-174组为64.33±1.14%,paca组为76.17±0.87%,随着效靶比浓度下降,杀瘤效率降低,在1∶1效靶比下杀瘤效率最低,LST-174组为13.23±0.48%,paca组为20.03±1.16%。  结论:1.经GM-CSF/SCF联合应用可诱导脐带血CD34+细胞生成大量前体DC细胞,并将前体DC细胞平均扩增可达105倍。  2.扩增后的脐带血CD34+来源的DC前体细胞可诱导分化为典型的未成熟DC细胞,培养第5天后其吞噬能力最强,最适合负载抗原;DC混合T淋巴细胞反应显示促增殖作用显著,表面分子CD80,CD83,CD86,HLA-DR表达率较高,是最理想的负载抗原、制备DC疫苗的时机。  3.负载LST-174、paca肿瘤全抗原的成熟DC诱导产生的CTL对两种肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。提示扩增之后的DC细胞制备的DC疫苗激活机体抗肿瘤免疫是可行和有效的。
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