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小球藻是单细胞真核生物,可食用,具有繁殖快,培养简单,可规模化生产等特点,具有开发为真核细胞生物反应器的潜力。
防御素具有广谱的微生物抗性,同时还具有免疫趋化活性和调动机体增加免疫力的特性。由于其独特的作用机理,目的微生物难以产生抗性突变,作为潜在的新一代抗生素药物具有广阔的应用前景。兔防御素NP-1是含有三对二硫键的阳离子小肽,二硫键配对正确与否对抗菌活性的影响很大。目前限制防御素应用的关键因素之一是无法规模化制备,现有的成熟的基因工程表达系统无法实现低成本、高水平表达及大规模制备。本论文构建了兔防御素NP-1基因的植物表达载体,NP-1基因(来自兔防御素NP-1成熟肽基因,为了在小球藻中能够翻译表达,在成熟肽的N-端添加甲硫氨酸的密码子)由Ubiquitin-1启动子控制,载体中含NptⅡ基因和硝酸还原酶基因两个筛选标记基因。以椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶缺失突变体nrm-4为受体,采用电穿孔法将NP-1基因转入该突变体中并通过抗生素G418和NaNO3筛选出阳性藻落。通过PCR和抑菌活性实验进一步检测阳性藻株。纯化了小球藻表达的NP-1并通过N-端测序鉴定。在撤去筛选压力并进行连续15代扩大培养后,纯化的藻株仍能够高水平表达NP-1,约为11.42±1.73 mg/L。离体实验表明,小球藻表达的NP-1具有很强的抑菌活性,对大肠杆菌的最低杀菌剂量(minimal bactericidalconcentration,MBC)为5μg/mL。
许多天然药用蛋白是糖蛋白,然而小球藻能否表达具有功能的糖蛋白还未见报道。人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,hFⅧ)是大分子糖蛋白,是治疗血友病A的特效制剂。本论文构建了B区缺失的重组人凝血因子Ⅷ基因(thFⅧ基因,具有6个糖基化位点)植物表达载体并导入了椭圆小球藻;经G418筛选出阳性转基因藻株;通过PCR、RT-PCR和Southern blot等分子生物学检测,表明thFⅧ基因已整合到小球藻基因组上并能够转录表达;用试剂盒Coamatic FⅧ Kit检测凝血活性,结果表明小球藻表达的重组人凝血因子Ⅷ具有天然人凝血因子Ⅷ的功能。通过human FⅧ-Ag ELISA assay检测表达量,结果显示转th FⅧ基因藻株表达thFⅧ的量约2 mg/L。初步建立了小球藻表达的重组人凝血因子Ⅷ的分类纯化方法,并进行了MALDI-TOF-MS分析。对重组人凝血因子Ⅷ的N-糖基化位点和类型进行了预测。
本研究结果为防御素和重组人凝血因子Ⅷ的生产提供了新的途径,为小球藻表达系统的应用提供了资料。